hBcl-2基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：H2O2對(duì)PC12細(xì)胞活性影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　 由于腦組織幾乎沒(méi)有供能物質(zhì)儲(chǔ)備，全部依靠血液循環(huán)帶來(lái)的氧、葡萄糖來(lái)維持和執(zhí)行正常的生理功能。腦組織對(duì)缺氧異常敏感，并且容易產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，其中氧自由基在氧化應(yīng)激損傷中起到了重要的作用。H2O2在實(shí)驗(yàn)中常用來(lái)模擬氧自由基的作用，而PC12細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)研究中可以作為神經(jīng)元的替代細(xì)胞。PC12是來(lái)源于嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株易培養(yǎng)可傳代，作為神經(jīng)元的

2、替代細(xì)胞是一個(gè)比較理想的細(xì)胞模型。
　　 目的：研究H2O2對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響。
　　 方法：培養(yǎng)PC12細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞貼壁約70％時(shí)用手拍打培養(yǎng)瓶讓細(xì)胞到培養(yǎng)液中，用移液器把細(xì)胞吹散。轉(zhuǎn)移適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中傳代，搖晃均勻制成細(xì)胞懸液，將PC12細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，調(diào)節(jié)PC12的密度為2×105ml。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，依次分為5組，加入PC12細(xì)胞培養(yǎng)基后，分別加入不同劑量

3、的H2O2 使其終濃度分別為(0、50、100、150、250、300nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)。8小時(shí)后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。另一方面我們用250nmol/L的H2O2分別處理PC12細(xì)胞0、2、4、6、8、10小時(shí)后更換培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　 結(jié)果：不同濃度的H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的活性有不同的影響，當(dāng)用50nmol/L的H2O2處理PC12細(xì)胞8小時(shí)，其活

4、性輕度增加(P<0.05)；當(dāng)處理時(shí)間不變H2O2濃度的進(jìn)一步提高時(shí)(濃度波動(dòng)于100-300nmol/L 范圍時(shí))，PC12細(xì)胞活性則受到明顯的抑制,當(dāng)H2O2 達(dá)到300nmol/L時(shí),大多數(shù)PC12細(xì)胞死亡(P<0.01)。
　　 當(dāng)用250nmol/L的H2O2 作用于培養(yǎng)的PC12細(xì)胞不同的時(shí)間段，PC12細(xì)胞活力隨時(shí)間依賴(lài)性下降，從處理6小時(shí)起始有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，PC12細(xì)胞活力較對(duì)照組相比有所下降。250

5、nmol/L的H2O2 作用于培養(yǎng)的PC12細(xì)胞8小時(shí),導(dǎo)致PC12細(xì)胞活性約為對(duì)照組的50％(P<0.05)，處理10小時(shí)PC12細(xì)胞活性明顯下降(P<0.01)。
　　 結(jié)論：不同濃度的H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的活性有不同的影響，低濃度的H2O2處理8小時(shí)對(duì)PC12細(xì)胞活力有一定的促進(jìn)作用，而中高濃度的H2O2 作用8小時(shí)PC12細(xì)胞的活力下降，H2O2 濃度越高及處理時(shí)間越長(zhǎng)，PC12細(xì)胞的活力下降越明顯。
　　 第

6、二部分：hBcl-2基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞保護(hù)作用的研究
　　 近年來(lái)，利用神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行腦卒中治療是實(shí)驗(yàn)研究中的熱點(diǎn)，而在神經(jīng)干細(xì)胞的研究中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞由于來(lái)源廣泛沒(méi)有社會(huì)倫理的限制得到了廣泛的應(yīng)用。本試驗(yàn)利用基因hBcl-2轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建了MSCs-hBcl-2基因工程細(xì)胞，并觀察其對(duì)體外培養(yǎng)的氧化損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 目的：觀察hBc l-2基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)體外培

7、養(yǎng)PC12細(xì)胞的作用。
　　 方法：采用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞、并利用其獨(dú)特的免疫學(xué)標(biāo)志作鑒定。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將pcDNA3-hBcl-2轉(zhuǎn)染MSCs 構(gòu)建MSCs-hBcl-2基因工程細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后用G418 進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞篩選，并搜集MSCs-hBcl-2基因工程細(xì)胞培養(yǎng)上清。將PC12細(xì)胞接種于96孔板中并分為4組(①M(fèi)SCs-hBcl-2組、②MSCs組、③MSCs 空質(zhì)粒組、④空白對(duì)照組)，

8、分別加入MSCs-hBcl-2 培養(yǎng)上清液、MSCs 培養(yǎng)上清液、MSCs 空質(zhì)粒培養(yǎng)上清液和PC12 培養(yǎng)基。使培養(yǎng)上清液的體積百分比為10％。然后使在H2O2 終濃度250nmol/L 作用下繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)。用MTT法檢測(cè)吸光度(A)值及TUNEL檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡的方法來(lái)觀察MSCs-hBcl-2基因工程細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)PC12細(xì)胞的影響。
　　 結(jié)果：成功的培養(yǎng)出MSCs，對(duì)傳代的骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化CD44、CD71染色

9、結(jié)果顯示所有細(xì)胞的胞漿或胞膜有棕黃色顆粒，提示其CD44、CD71表面標(biāo)志表達(dá)陽(yáng)性。將hBcl-2基因成功的轉(zhuǎn)染了MSCs 構(gòu)建了MSCs-hBcl-2基因工程細(xì)胞，用G418 篩選后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞均有hBcl-2 蛋白的表達(dá)。氧化損傷的PC12細(xì)胞中加入各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液后對(duì)其有一定的保護(hù)作用，不同的細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用不同，MSCs-hBcl-2組保護(hù)作用最強(qiáng)(P<0.01)。
　　 MSCs組有一定的保

10、護(hù)作用(P<0.05)，MSCs-hBcl-2組較MSCs組具有更強(qiáng)的保護(hù)作用(P<0.05)。MSCs-hBcl-2組較MSCs組的TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。MSCs組與對(duì)照組相比TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減低(P<0.05)。MSCshBcl-2組與對(duì)照組相比TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減低(P<0.01)。
　　 結(jié)論：MSCs-hBcl-2基因工程細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)及抗調(diào)亡作用比骨髓基質(zhì)細(xì)