SMS2基因敲除小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬現(xiàn)象的研究.pdf

1、自噬是存在于真核細(xì)胞中普遍的生命現(xiàn)象，是近十年來生命科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，在降解胞內(nèi)蛋白、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重建、清除廢物、保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮著非常重要的作用。自噬對(duì)于降解錯(cuò)誤折疊和聚集蛋白方面起著關(guān)鍵的作用，與神經(jīng)變性疾病關(guān)系密切，受到越來越多研究者的關(guān)注。本課題以SMS2基因敲除（SMS2-/-）小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用MAPLC3和Beclin-1 免疫細(xì)胞化學(xué)，PCR、電鏡和Western blotting等技術(shù)方法，以期探討

2、SMS2基因敲除小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)一種重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的第二信使-神經(jīng)酰胺增多后，對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞自噬現(xiàn)象的影響，為通過誘導(dǎo)自噬治療神經(jīng)變性疾病提供臨床治療依據(jù)。
　　 為了研究SMS2基因敲除小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺增多后，對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞自噬現(xiàn)象的影響，本實(shí)驗(yàn)室從美國紐約州立大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心引進(jìn)的SMS2基因敲除小鼠的雜合子SMS2+/-小鼠為種鼠，利用PCR 方法鑒定培育出的SMS2-/-小鼠為模型，探討神經(jīng)酰胺對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬

3、的影響，從而為神經(jīng)變性疾病的臨床治療和和預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　 目的：利用SMS2基因敲除小鼠探討神經(jīng)酰胺對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬現(xiàn)象的影響，從而為神經(jīng)變性疾病的臨床治療和和預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　 方法：利用從美國紐約州立大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心引進(jìn)的SMS2+/-小鼠（雄性一只，雌性兩只，背景為C57BL/6J小鼠）為種鼠，將雜合子SMS2+/-小鼠采用雜交、回交、互交的方法進(jìn)行繁殖，用酚氯仿提取法提取小鼠基因組DNA，PCR

4、擴(kuò)增目的基因，瓊脂糖凝膠電泳對(duì)小鼠基因型做出鑒定，獲得雄性和雌性純合子SMS2-/-小鼠，按照同樣方法進(jìn)行繁殖；以SMS2-/-小鼠為研究對(duì)象，野生型（WT）小鼠為對(duì)照組，利用透射電子顯微鏡觀察P14和P30模型組與對(duì)照組海馬神經(jīng)細(xì)胞中自噬和自噬溶酶體結(jié)構(gòu)；利用免疫熒光染色技術(shù)觀察P7、P14和P30模型組和對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞自噬細(xì)胞數(shù)，并觀察Beclin-1與MAPLC3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色在神經(jīng)細(xì)胞的共表達(dá)情況；利用Western blo

5、tting 方法檢測(cè)P14和P30模型組與對(duì)照組小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞MAPLC3的蛋白水平；采用單因素方差分析LSD 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果：1.SMS2-/-小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬現(xiàn)象：①電子顯微鏡下，SMS2-/-小鼠較WT小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多自噬體或自噬溶酶體樣結(jié)構(gòu)；②光鏡下，SMS2-/-小鼠P7、P14和P30 CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬細(xì)胞數(shù)較WT小鼠高，變化有顯著差異（P﹤0.01）。2.Beclin-1

6、 對(duì)于自噬的調(diào)節(jié)作用：①Beclin-1 在SMS2-/-小鼠與WT小鼠的表達(dá)情況比較與MAPLC3基本一致，P7、P14和P30 SMS2-/-小鼠Beclin-1 陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（P<0.01）。②Beclin-1 與MAPLC3 二者在同一細(xì)胞中基本呈重疊表達(dá)3.利用Western blotting 檢測(cè)P14和P30 SMS2-/-小鼠和WT小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞MAPLC3蛋白的相對(duì)表達(dá)量，SMS2-/-小鼠較W