酸棗仁皂甙A對海馬神經(jīng)細(xì)胞及GABA受體基因表達(dá)的影響.pdf

1、酸棗仁在我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中被廣泛用于治療失眠和焦慮癥，整體動物實(shí)驗(yàn)證明其具有鎮(zhèn)靜安神功效，酸棗仁皂甙A（JuA）是其主要提取物。有研究報(bào)道證明JuA是一種對鈣調(diào)蛋白（CaM）的非競爭性抑制劑，對小鼠自發(fā)活動有抑制作用。近期研究報(bào)道證明高劑量 JuA可以抑制海馬 CA1區(qū)由于青霉素鈉介導(dǎo)的過度活動，JuA對在體和體外大鼠海馬內(nèi)谷氨酸介導(dǎo)的興奮信號通路具有抑制作用。以上證明 JuA對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）具有抑制作用，尤其是在海馬。海馬作為邊

2、緣系統(tǒng)的重要組成部分，神經(jīng)元高度集中，具有相對簡單而高度序化的層狀結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元相對獨(dú)立分布，在睡眠、學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)及植物神經(jīng)功能方面有重要作用。我們實(shí)驗(yàn)室在以往的研究工作中，用JuA作用于整體動物，檢測小鼠自發(fā)活動，證明其具有鎮(zhèn)靜催眠作用。γ－氨基丁酸（GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其傳遞作用由GABA受體介導(dǎo)，存在于神經(jīng)元膜上的GABA受體，在腦區(qū)內(nèi)介導(dǎo)突觸前抑制和突觸后抑制效應(yīng)。該受體與人的許多神經(jīng)性疾病密切

3、相關(guān)，包括癲癇、酒精中毒、失眠和帕金森綜合征等。GABAA受體和苯二氮卓類藥物鎮(zhèn)靜催眠作用密切相關(guān)，并且與鎮(zhèn)靜催眠作用密切相關(guān)的部分受體在出生后發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞上高表達(dá)。我們前期的工作初步提供了JuA發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的證據(jù)，但是目前尚未有關(guān)于酸棗仁皂甙A（JuA）對海馬神經(jīng)細(xì)胞作用以及對其上GABA受體基因表達(dá)影響的研究報(bào)道，JuA對海馬神經(jīng)細(xì)胞作用的機(jī)制是什么，是否和傳統(tǒng)經(jīng)典的苯二氮卓類藥物相似，通過作用于GABA受體發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作

4、用，其抑制作用的分子機(jī)理等還不清楚。本研究采用現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)對JuA鎮(zhèn)靜催眠分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　我們首先進(jìn)行了體外新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，對文獻(xiàn)報(bào)道的原代神經(jīng)元培養(yǎng)方案進(jìn)行了優(yōu)化，并且用細(xì)胞骨架蛋白微管相關(guān)蛋白（MAP2）作為標(biāo)志物，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光方法，對培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示培養(yǎng)物為MAP2陽性細(xì)胞，表明培養(yǎng)物為高純度的海馬神經(jīng)細(xì)胞，可以進(jìn)一步用于JuA對其作用的研究。
　　其次，我們以

5、 JuA作用于培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞作為研究對象，觀察其對海馬神經(jīng)細(xì)胞的影響。首先，在相差顯微鏡下，我們觀察到了相當(dāng)數(shù)量具有典型外形特征的海馬神經(jīng)細(xì)胞，然后運(yùn)用MTT方法檢測JuA對海馬神經(jīng)細(xì)胞生長存活率的影響，不同濃度JuA（0.05g/L和0.01g/L）與海馬神經(jīng)細(xì)胞共同孵育7d，與空白對照組比較可見兩個(gè)濃度JuA作用于海馬神經(jīng)細(xì)胞后，其MTT值均明顯上升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JuA組的海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯高于對照組（p﹤0.05

6、），0.05g/L和0.1g/L濃度的JuA對海馬神經(jīng)細(xì)胞的生長均有促進(jìn)作用，能明顯提高海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活率，且呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，提示本試驗(yàn)中所選取的兩個(gè)濃度JuA對體外培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的生長有一定的促進(jìn)和保護(hù)作用。
　　最后，我們對JuA鎮(zhèn)靜催眠作用可能的分子機(jī)理進(jìn)行了初步探討。我們以體外培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞作為研究對象，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測JuA對培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞GABA受體基因表

7、達(dá)量的影響，并且和地西泮（DZ）作用結(jié)果相比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0.1 g/L JuA和10μM DZ作用于海馬神經(jīng)細(xì)胞24h后，均能上調(diào)部分 GABA受體基因?1、?5和R1及下調(diào)?2的表達(dá)量；而高劑量0.1 g/L JuA作用72小時(shí)后能下調(diào)?1和?2的表達(dá)量，對?5和R1的表達(dá)量無明顯影響，此結(jié)果不同于地西泮作用72h后所介導(dǎo)的α1、α5、β2和R1表達(dá)量的降低；低劑量JuA作用24h及72h后都能上調(diào)部分GABA受體基因α1、α5、

8、?2和R1的表達(dá)量。JuA和地西泮作用于海馬神經(jīng)細(xì)胞不同時(shí)間均能引起部分GABA受體基因（α1、α5、?2和R1）表達(dá)量變化，提示0.1 g/L JuA短時(shí)間作用可能能夠介導(dǎo)鎮(zhèn)靜催眠作用和肌肉松弛作用，而長時(shí)間作用則有可能同地西泮相似能導(dǎo)致耐受性和成癮性；然而，低劑量0.05 g/L JuA無論短時(shí)間或長時(shí)間作用均可能誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜催眠和肌松作用，并且沒有明顯的誘導(dǎo)耐受性和成癮性的傾向。所以，0.1 g/L和0.05 g/L劑量的JuA均可能