多態(tài)性MICA基因同種異體移植瘤模型的建立與研究.pdf

1、引言：
　　主要組織相容復合物I類相關基因A(majorhistocompatibilitycomplexclassIchain-ralatedgeneA,MICA)是MIC基因家族的功能性基因，是參與機體免疫的重要免疫分子，具有較豐富的多態(tài)性，其編碼的蛋白作為活化性受體NKG2D的配體，與NKG2D/DAP10結合，參與移植免疫、腫瘤免疫及多種自身免疫疾病，并在免疫監(jiān)視作用及腫瘤逃逸免疫中發(fā)揮重要作用。國內外多項研究表明MICA

2、基因由于較高的多態(tài)性與其發(fā)揮的免疫學效應尤其是移植免疫聯系緊密，目前已發(fā)現68個等位基因，并且存在著廣泛的地域及人種差別。關于MICA基因多態(tài)性的研究逐漸成為對MICA基因研究的熱點，目前越來越多的研究證明，MICA基因存在多態(tài)性現象，MICA基因及其抗體在多種器官移植中參與術后移植物抗宿主反應（GVHR）及宿主抗移植物反應（HVGR）。目前關于MICA等位基因配型及其抗體在器官移植中產生的免疫學效應國內外尚未見報道，我們旨在建立一套多

3、態(tài)性MICA基因同種異體移植瘤模型，在受供體HLA配型完全一致的情況下，能夠專一性反映不同MICA等位基因及其配型在移植免疫中所起到的作用。
　　目的：
　　通過病毒轉化人外周血單個核細胞（PBMC），并通過序列特異性PCR（PCR-SSP）分析，建立特定HLA及MICA基因型的B淋巴母細胞系（BLCL）。建立中國人群常見MICA等位基因的真核表達載體。應用人源化免疫NOD/SCID鼠方案，建立可模擬體內免疫環(huán)境的小鼠模型，

4、進而建立多態(tài)性MICA基因同種異體移植瘤模型，為后續(xù)研究不同MICA等位基因在器官移植中所起的免疫學作用提供理論依據及試驗基礎。
　　方法：
　　本實驗包含四個部分。第一部分，制備EBV病毒上清，并通過EBV轉化人外周血單個核細胞，建立B淋巴母細胞系。第二部分，合成可用于鑒定MICA等位基因的PCR混合引物對，通過PCR-SSP分析MICA基因特異性位點，進而確定試驗對象的MICA基因型，為MICA等位基因篩選及MICA配型

5、提供試驗依據。第三部分，同過PCR-SSP對本實驗室常見細胞系MICA基因特異性位點進行分析，預篩選出特定MICA等位基因的目的細胞系，提取RNA，逆轉錄PCR獲取包含特定MICA等位基因的cDNA全長片段，連接到真核表達載體，構建特定等位基因的MICA質粒。第四部分，通過NOD/SCID小鼠腹腔注射與移植瘤HLA及MICA相同配型的PBMC，建立人源化免疫NOD/SCID小鼠多態(tài)性MICA基因同種異體移植瘤模型。
　　結果：

6、r>　　1.建立了特定HLA及MICA基因型的B淋巴母細胞系，細胞分裂增殖良好，鏡下成團簇狀懸浮于培養(yǎng)液，每次傳代后凍存數支于液氮中，并可復蘇及繼續(xù)傳代。
　　2.合成了可供分析中國人群9種常見MICA等位基因的PCR混合引物對，對目的DNA產物進行PCR-SSP試驗，通過特異性位點的凝膠電泳條帶，鑒定了建系細胞系BLCL的MICA等位基因屬于MICA*008，并完成了本實驗室常見細胞系特定MICA基因預篩選，確定7901胃癌細胞

7、系包含目的基因MICA*008。
　　3.在MICA等位基因預篩選的基礎上，成功構建包含MICA*008基因完整外顯子的真核表達載體pcDNA3(+)/MICA*008，轉染后成功表達由MICA*008基因所編碼的MICA膜蛋白，驗證了應用PCR-SSP技術對細胞系中對特定MICA等位基因預篩選及構建質粒的可行性。
　　4.通過動物實驗論證，人免疫源性的NOD/SCID小鼠對特定HLA及MICA基因型移植瘤組與未經人源化免疫

8、的NOD/SCID小鼠組對比，移植物成形時間及生長速度上，人源化組均慢于對照組，說明包含多態(tài)性MICA基因的移植瘤模型的建立是成功的。
　　結論：
　　本研究通過PCR-SSP的方法，鑒定了常見細胞系及BLCL的MICA基因特異性位點，由此建立了包含特定MICA等位基因的細胞系BLCL,建立了包含特定MICA等位基因的真和表達載體pcDNA3(+)/MICA*008。通過與建系細胞系相同個體的外周血單個核細胞免疫NOD/SC