背根節(jié)神經(jīng)元的興奮性分型與Reluzole對(duì)INaP的抑制作用.pdf

1、神經(jīng)病理性痛是指外傷、缺血、中毒或者機(jī)體代謝異常造成的神經(jīng)病理性損傷，以痛覺過敏、觸誘發(fā)痛、感覺倒錯(cuò)以及自發(fā)性疼痛為主要表現(xiàn)。背根節(jié)(DorsalRootGanglion,DRG)神經(jīng)元是初級(jí)感覺神經(jīng)元胞體的集合，是外周感覺傳入的中轉(zhuǎn)站。生理情況下，其主要功能是將神經(jīng)末梢感受器換能產(chǎn)生的動(dòng)作電位信息忠實(shí)的傳遞至脊髓，從而保證信息的完整性。然而在某些病理性條件下，如DRG受到直接或間接損傷后，神經(jīng)元胞體將出現(xiàn)興奮性的異常增高，產(chǎn)生形式多樣

2、的異位自發(fā)放電活動(dòng)。該放電已被證明是產(chǎn)生多種異常疼痛感覺的慢性痛信號(hào)。
　　興奮性是指可興奮細(xì)胞受到刺激時(shí)產(chǎn)生動(dòng)作電位(actionpotential，AP)的能力，傳統(tǒng)觀念以閾值高低或產(chǎn)生AP的多少衡量興奮性的高低。損傷造成的DRG興奮性的變化，從傳統(tǒng)的電生理檢測(cè)角度觀察，有閾值與適應(yīng)性的變化，而基于Hodgkin-Huxley的理論，亦可表現(xiàn)為興奮性類型的變化。Hodgkin于1948年在青蟹神經(jīng)軸突上發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元興奮性按照其刺

3、激電流強(qiáng)度與放電頻率之間的關(guān)系可分為三種類型[1]。第一種類型對(duì)注入電流非常敏感，第二種類型在電流強(qiáng)度增加時(shí)放電頻率保持恒定并維持在較高水平，第三種放電類型在較高的刺激下只產(chǎn)生1-2個(gè)放電。我們實(shí)驗(yàn)室既往的工作在三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元證實(shí)了這一分類的存在，并對(duì)二型神經(jīng)元的分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了補(bǔ)充[2]。對(duì)于背根節(jié)，我室既往研究發(fā)現(xiàn)DRG神經(jīng)元具有周期和簇狀放電，并且表現(xiàn)閾下膜電位振蕩活動(dòng)，損傷后該比例增高。該現(xiàn)象提示，在DRG神經(jīng)元可能存在著上

4、述興奮性分型的表現(xiàn)。
　　RinzelJ的工作提示，不同類型興奮性的產(chǎn)生是因?yàn)樯窠?jīng)元經(jīng)歷了不同的從靜息態(tài)到放電態(tài)的不同動(dòng)力學(xué)分叉[3]。神經(jīng)元興奮性分型的確定有助于我們了解細(xì)胞在外界刺激后發(fā)生怎樣的反應(yīng)，即細(xì)胞對(duì)外界信息具有怎樣的編碼作用。同時(shí)，神經(jīng)動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)認(rèn)為，離子電流參數(shù)的改變可以導(dǎo)致興奮性類型的轉(zhuǎn)化。不同興奮性類型神經(jīng)元所含離子電流成分的比例不同可能導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性的改變。在CCD模型[4]的諸多研究表明，神經(jīng)元超興奮的發(fā)

5、生與一種慢失活的Na電流，又稱持續(xù)Na電流（INaP）的增多有著密切關(guān)系，而CCD模型前后分型比率的變化是否也伴隨著INaP電流的變化，對(duì)該問題的闡明有助于我們深入解釋超興奮發(fā)生的本質(zhì)過程。
　　結(jié)果主要包括兩部分:
　　第一部分：背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元興奮性的分類與轉(zhuǎn)型。
　　本文擬對(duì)DRG神經(jīng)元的興奮性特征進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否存在上述的興奮性分型的表現(xiàn)，進(jìn)而在慢性背根節(jié)壓迫神經(jīng)病痛模型對(duì)這一分型比率是否變化進(jìn)行分

6、析，期望從興奮性分型角度對(duì)慢性痛信號(hào)的形成作深入探討。既往實(shí)驗(yàn)室在三叉神經(jīng)中腦核的工作[2]還提示，INaP在細(xì)胞興奮性分型乃至分型之間的轉(zhuǎn)化中有著十分重要的作用，我們隨后的工作即對(duì)分型比率變化的可能的離子通道機(jī)制進(jìn)行探討。
　　實(shí)驗(yàn)運(yùn)用我室創(chuàng)建的背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫模型（CCD模型），對(duì)背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行整節(jié)消化后，利用電流鉗及電壓鉗的方法對(duì)DRG中、大神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。
　　結(jié)果如下：
　　1.正常DRG神經(jīng)元

7、的三種興奮性類型：
　　對(duì)179個(gè)正常DRG神經(jīng)元施加去極化方波刺激及去極化斜波刺激，觀察到三種不同的興奮性類型。1型興奮性神經(jīng)元占13％（23/179）：其閾值較低，放電頻率隨著刺激電流強(qiáng)度的增強(qiáng)而線性增加，在去極化斜波刺激條件下，1型神經(jīng)元的放電頻率隨著膜電位的逐漸去極化由低到高，呈線性增加，動(dòng)作電位之前沒有出現(xiàn)閾下膜電位振蕩(SMPO)。2型興奮性神經(jīng)元占27％（48/179）：其閾值相對(duì)1型興奮性神經(jīng)元較高，達(dá)到閾值后，動(dòng)

8、作電位成串出現(xiàn)，放電頻率對(duì)刺激電流的強(qiáng)度變化相對(duì)不敏感。在去極化斜波刺激條件下，2型神經(jīng)元在膜電位去極化的過程中出現(xiàn)了SMPO，并在SMPO的基礎(chǔ)上產(chǎn)生動(dòng)作電位。3型興奮性神經(jīng)元占60％（108/179）：不僅閾值電流較高，在去極化方波刺激下通常只產(chǎn)生1個(gè)AP，而且在去極化斜波刺激條件下，3型興奮性神經(jīng)元沒有出現(xiàn)AP。
　　2.正常DRG三種興奮性類型神經(jīng)元的持續(xù)鈉電流（INap）
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)INaP電流幅值在三種興奮性類

9、型的神經(jīng)元上有顯著差異，其在2型神經(jīng)元上幅值最高((-394.5±58.97)pA,n=8)，在3型神經(jīng)元上幅值最低((-27.5±27.5)pA,n=3)，在1型神經(jīng)元上則介于兩者之間((-219.333±43.5367)pA,n=10)。
　　3.CCD模型三種興奮性分型的比例變化
　　在CCD模型DRG神經(jīng)元三種興奮性分型的比例變化，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)病理性損傷后，三種類型的分布發(fā)生了顯著性改變，1型神經(jīng)元明顯增多，3型神經(jīng)元顯

10、著減少。說明CCD模型術(shù)后3型興奮性神經(jīng)元向2型、1型興奮性神經(jīng)元轉(zhuǎn)變。
　　4.CCD模型三種興奮性神經(jīng)元INaP的變化
　　CCD組DRG不同類型神經(jīng)元INaP的電流值與正常組比較發(fā)生了明顯變化，其中CCD組1型、2型興奮性神經(jīng)元的INaP有不同程度的增高。
　　主要結(jié)論：
　　1、正常DRG神經(jīng)元存在三種興奮性類型；INaP電流在正常三種興奮性神經(jīng)元分布明顯不同。
　　2、在CCD組神經(jīng)元興奮性分型的

11、比例發(fā)生了顯著改變；其中1與2型神經(jīng)元的INaP有不同程度的增高。
　　3、DRG神經(jīng)元損傷后分型比例的變化以及INaP的增高提示神經(jīng)病理性損傷導(dǎo)致的最終電生理變化可能與INaP的變化密切相關(guān)，而這種結(jié)果提示我們調(diào)節(jié)INaP的變化可能成為影響神經(jīng)病理性損傷后電變化的重要手段。
　　第二部分：Riluzole對(duì)INaP的抑制作用。
　　利魯唑（riluzole）在臨床上被用來治療神經(jīng)紊亂性疾病，包括肌萎縮側(cè)索硬化癥（AL

12、S）[5]，或者作為一種神經(jīng)保護(hù)劑，被用來治療脊髓[6]和腦部損傷[7]。Riluzole同時(shí)也被用于緩解神經(jīng)病理性痛，但作用靶位不清楚。目前在臨床應(yīng)用以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有爭(zhēng)論的結(jié)果要求我們對(duì)riluzole的細(xì)胞及分子機(jī)制加以研究。近來，一系列的報(bào)道提出持續(xù)鈉電流（INaP）在中樞神經(jīng)元中主要參與神經(jīng)元興奮性及節(jié)律的產(chǎn)生[8-11]，而riluzole可作為INaP通道相對(duì)特異的阻斷劑[12-18]。為了避免riluzole在中樞神經(jīng)系統(tǒng)

13、的復(fù)雜性，我們將研究其在外周初級(jí)感覺傳入背根節(jié)上的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。研究中應(yīng)用了我室創(chuàng)建的背根節(jié)慢性壓迫模型，該模型在手術(shù)側(cè)可以誘發(fā)明顯的機(jī)械觸誘發(fā)痛行為[4]。本研究室發(fā)現(xiàn)riluzole可以抑制CCD模型DRG神經(jīng)元的自發(fā)放電，發(fā)揮外周鎮(zhèn)痛作用(見鄭大偉碩士畢業(yè)論文)，然而其在外周鎮(zhèn)痛作用的具體環(huán)節(jié)與機(jī)制卻不明了。為了判定持續(xù)流INaP在riluzole實(shí)現(xiàn)外周鎮(zhèn)痛效應(yīng)中可能發(fā)揮的重要作用，本課題利用上述檢測(cè)INaP的膜片鉗技術(shù)進(jìn)一步對(duì)r

14、iluzole作用的細(xì)胞電生理機(jī)制進(jìn)行了分析，主要結(jié)果如下：
　　1.Riluzole通過抑制閾下膜電位振蕩(subthresholdmembranepotentialoscillation,SMPO)進(jìn)而抑制受損DRG神經(jīng)元的自發(fā)放電。
　　在CCD術(shù)后大鼠背根節(jié)離體標(biāo)本上應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究了28例大中型神經(jīng)元。應(yīng)用時(shí)長(zhǎng)為800ms的去極化方波注入電流刺激，其中35％神經(jīng)元（10/28）表現(xiàn)出SMPO及高頻放電。應(yīng)用

15、10μMRiluzole后SMPO消失，重復(fù)放電減少并在用藥3min后消失。但該濃度并不影響其去極化誘發(fā)的首個(gè)動(dòng)作電位。
　　2.Riluzole顯著抑制INaP
　　2μM的Riluzole對(duì)INaP就有很強(qiáng)的抑制作用。細(xì)胞被鉗制在-60mV后，應(yīng)用3s的從-80到0mV的去極化斜波鉗制電位來測(cè)量INaP。內(nèi)向鈉電流在-60～-50mV之間被激活，在-35mV左右達(dá)到峰值，并可被TTX阻斷。研究結(jié)果表明損傷A類DRG神經(jīng)元

16、的INaP對(duì)riluzole的抑制有劑量依賴關(guān)系。
　　3.Riluzole對(duì)快電流（INaT）無明顯抑制作用
　　100μM的riluzole對(duì)INaT僅有較少影響。我們測(cè)量了riluzole對(duì)TTX敏感的瞬時(shí)鈉電流（INaT）的作用，發(fā)現(xiàn)riluzole只有在較高劑量時(shí)（500μM）才對(duì)INaT產(chǎn)生顯著減小的影響。
　　結(jié)論：
　　Riluzole可能通過抑制受損背根節(jié)神經(jīng)元的INaP,進(jìn)而抑制異位自發(fā)放電的