單克隆抗體ZUC3免疫磁珠分選人骨髓間充質(zhì)干細胞的方法研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是骨髓組織中除造血干細胞外的一種非造血組織的成體干細胞。MSCs具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力，在一定的體內(nèi)或體外誘導條件下可以分化為各個胚層的細胞，如脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肌腱細胞、肌肉細胞、神經(jīng)元細胞、上皮細胞等。本研究組以人骨髓MSCs為抗原免疫BALB/C小鼠，采用雜交瘤技術成功制備了一株新的抗人骨髓MSCs單克隆抗體，命名為ZUC3，抗體亞型

2、為IgM，并已證實其對人骨髓MSCs有高度的特異性。本研究將應用單克隆抗體ZUC3，通過正向免疫分選的方法從人骨髓單個核細胞中分離純化原代MSCs，進一步鑒定ZUC3抗原陽性MSCs在體外培養(yǎng)擴增、多向分化的潛能，以初步探討一種較理想的人骨髓MSCs原代細胞的分離純化方法。本研究首先將抗人骨髓MSCs單克隆抗體雜交瘤細胞株ZUC3復蘇并擴增，以每只小鼠1.0×106細胞接種于經(jīng)液體石蠟預處理過的BALB/C小鼠腹腔，誘生腹水。收集腹水，

3、采用鹽析法純化腹水抗體。經(jīng)間接免疫熒光染色法測定抗體效價為1∶104。以單克隆抗體ZUC3為探針，通過流式細胞儀分析顯示ZUC3抗原在人骨髓MSCs、人骨髓單個核細胞、人外周血單個核細胞中的陽性率分別為91.31±2.92％、0.96±0.28％、0.24±0.05％，通過間接免疫熒光染色法證實單克隆抗體ZUC3與被檢的骨髓來源的8個細胞株(HL-60、NB4、K562、U-937、HEL、Jurkat、Raji、KM3)均無交叉反應。

4、結果提示單克隆抗體ZUC3與人骨髓MSCs表面抗原結合，有高度特異性，可作為細胞分選的免疫標記。 為鑒定從人骨髓單個核細胞中分選獲得的ZUC3抗原陽性細胞的多向分化潛能，本研究應用脂肪誘導分化劑(StemCellInc.)和成骨誘導分化劑(10-8M地塞米松，10mMβ磷酸甘油，0.2mM抗壞血酸，10％(V/V)FBS的LG-DMEM培養(yǎng)液)成功誘導ZUC3抗原陽性細胞向成脂肪細胞和成骨細胞分化。經(jīng)成脂肪誘導劑培養(yǎng)后，油紅O染

5、色觀察到大量橙紅色脂肪細胞；經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)1周后出現(xiàn)方形或多角形細胞以及鈣化結節(jié)，培養(yǎng)20天后VonKossa法染色，可見染成棕黑色的細胞外基質(zhì)鈣鹽沉積。提示以單克隆抗體ZUC3為標記，通過正向免疫分選的ZUC3抗原陽性細胞具有多向分化潛能，可以在體外誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞。綜上所述，本研究得出以下結論： 1.單克隆抗體ZUC3與人骨髓MSCs表面抗原結合，有高度特異性，可作為細胞分選的免疫標記。 2.單克隆抗體Z

6、UC3間接免疫磁珠正向分選法可有效地從人骨髓單個核細胞中分離獲得ZUC3抗原陽性細胞，且分選細胞具有較好的活力，可在體外培養(yǎng)。 3.單克隆抗體ZUC3間接免疫磁珠分選法獲得的ZUC3抗原陽性細胞體外培養(yǎng)，原代細胞貼壁呈梭形、集落樣分布，細胞形態(tài)均一，與成纖維細胞形態(tài)相似，排列成漩渦狀、輻射狀；細胞傳代后生長迅速，增殖快，具有很好的增殖活性。分選獲得的ZUC3抗原陰性細胞僅見少量的貼壁細胞，不具有增殖能力。4.ZUC3抗原陽性細胞

7、在體外傳代培養(yǎng)后表面分子CD29、CD44、CD105、CD166陽性，而造血細胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達均為陰性，是一均質(zhì)的細胞群，不含造血細胞。 5.ZUC3抗原陽性細胞具有多向分化潛能，可以在體外誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞。 6.從人骨髓單個核細胞中分離獲得的ZUC3抗原陽性細胞具有體外擴增、多向分化的潛能及MSCs典型的表型特征，單克隆抗體ZUC3免疫磁珠分選人骨髓MSCs可以做為