人細(xì)胞色素P450氧化還原酶在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá).pdf

1、目的：利用bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對人的Cytochrome P450 Reductase(CPR)的基因得以表達(dá),得到CPR的真核表達(dá)產(chǎn)物,為CPR的功能研究以及藥物體外代謝奠定基礎(chǔ)。 方法：設(shè)計引物,擴(kuò)增得到Cytochrome P450 Reductase(CPR)的開放閱讀框(ORF),將其克隆到供體質(zhì)粒pFastBacTM1中,經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定后,將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac菌,經(jīng)篩選、鑒定后

2、,抽提并獲取高純度的重組穿梭載體Bacmid-cpr。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組穿梭載體Bacmid-cpr轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞,獲得重組病毒,并反復(fù)擴(kuò)增后得到大量表達(dá)CPR蛋白的重組桿狀病毒。用重組的桿狀病毒再次感染Sf9昆蟲細(xì)胞得到Cytochrome P450 Reductase(CPR)蛋白,并對蛋白進(jìn)行Western-blot鑒定。 結(jié)果：1.構(gòu)建了攜帶cpr基因片段的重組供體質(zhì)粒pFastBac 1-cpr,經(jīng)PCR鑒定,雙

3、酶切鑒定和序列分析證實cpr基因已正確插入供體質(zhì)粒的多克隆位點；2.構(gòu)建了攜帶cpr基因片段的重組穿梭載體Bacmid-cpr,經(jīng)PCR鑒定分析證實cpr基因已正確轉(zhuǎn)座插入穿梭載體的轉(zhuǎn)座位點；3.用bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了CPR蛋白,并經(jīng)Western-blot分析鑒定,分子量約為78kD,與理論分子量相符。 結(jié)論：本研究成功地在桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了CPR蛋白,為CPR蛋白的進(jìn)一步的功能研究和實際應(yīng)用