抗山羊傳染性胸膜肺炎支原體PG-,3-單克隆抗體的制備及研究.pdf

1、目的；使用本實驗室研制的改良型固體Hartleys培養(yǎng)基培養(yǎng)絲狀支原體山羊亞種PG3株，獲得菌體經(jīng)凍融裂解制備抗原；通過動物免疫、間接ELISA方法建立、細胞融合、陽性克隆篩選、亞克隆，獲得能分泌抗體的單克隆細胞株；制備、純化腹水，進行效價和特異性鑒定，以獲得效價高、特異性強的單克隆細胞株；為研究絲狀支原體山羊亞種表面抗原結構、篩選保護性抗原奠定基礎；同時以單克隆抗體為包被原，山羊抗PG3純化多抗為夾心抗體，建立雙抗夾心ELISA方法，

2、為山羊傳染性胸膜肺炎的診斷、流行病學調(diào)查建立一種簡單、快速、特異性強、靈敏度高的方法。 方法；結合國內(nèi)外文獻報道依據(jù)本實驗室的具體情況，使用本實驗室研制成功的“改良型Hartleys培養(yǎng)基”進行絲狀支原體山羊亞種PG3的復蘇和擴大培養(yǎng)；從固體培養(yǎng)基上洗脫菌體，經(jīng)低速離心去除沉淀，上清液高速離心獲得菌體，使用PBS洗滌三次，-20℃凍融裂解后低速離心棄除沉淀，獲得上清即為膜蛋白，測定蛋白含量。將所得膜蛋白以一定量與弗氏佐劑混合充分

3、乳化，免疫BALB/c小鼠，330μg/只，共免疫四次；采血測定血清抗體效價并建立間接ELISA方法，待血清效價大于1∶5000時進行細胞融合。取血清效價高的BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50％PEG1500的作用下進行細胞融合；使用已建立的間接ELISA進行篩選，陽性孔采用有限稀釋法進行亞克??；得到的單克隆細胞株進行擴大凍存及腹水制備。腹水進行效價測定、特異性檢測；使用試劑盒測定其抗體亞型，進行抗體純化、純度檢測。以純

4、化的單抗包被酶標板、純化山羊抗PG3多抗作為夾心抗體，建立雙抗夾心ELISA方法并進行特異性、靈敏度檢測及初步應用。 結果；絲狀支原體山羊亞種PG3在改良型Hartleys培養(yǎng)基得到成功復蘇和擴大培養(yǎng)，膜蛋白質(zhì)含量為1.65mg/mL；四次免疫后小鼠抗體效價達到1∶6400以上。以50％PEG1500進行細胞融合，融合孔為364孔，融合率達到75.8％；經(jīng)間接ELISA篩選，共得31個陽性孔，陽性率為8.5％，兩次亞克隆后得到四

5、株單克隆細胞株：1C10、1E2、2E8、2F12，經(jīng)腹水制備、效價檢測、特異性檢測最終得到1E2株，其抗體亞型為IgG3、κ型，SDS-PAGE檢測純度較高。建立的雙抗夾心ELISA單抗包被濃度為1∶200稀釋(20μg/mL)，山羊抗PG3多抗工作濃度為1∶400稀釋，其檢測下限為2μg/mL，檢測豬肺炎支原體、雞滑液支原體、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、馬血清等均為陰性。使用雙抗夾心ELISA和間接ELISA對12份

6、有臨床癥狀山羊的鼻腔拭子、血清進行檢測，前者陽性率為58.3％，后者陽性率為66.7％；對于其中癥狀典型的5只，雙抗夾心ELISA檢測全為陽性，陽性率100％，間接ELISA陽性為3只，陽性率60％。僅偶見干咳的7只，雙抗夾心ELISA檢測出2只陽性，陽性率28.6％，間接ELISA法檢測出5只陽性，陽性率71.4％。 結論；使用改良型Hartleys培養(yǎng)基及凍融法成功地獲得了PG3膜蛋白，通過動物免疫、細胞融合、間接ELISA