斑蝥酸鈉對人多藥耐藥K562-AO-,2-細(xì)胞的體外作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：腫瘤化療失敗的原因往往是多藥耐藥(MDR)的出現(xiàn)，因此有效地控制MDR的發(fā)生已成為腫瘤治療的關(guān)鍵。目前開發(fā)的MDR逆轉(zhuǎn)劑因毒副作用大或作用靶點(diǎn)單一等而無法達(dá)到令人滿意的程度。中藥因資源豐富、低毒、作用靶點(diǎn)多、價格便宜等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑研究的重點(diǎn)。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)觀察中藥斑蝥酸鈉(SCA)對人多藥耐藥K562/AO<,2>細(xì)胞是否有逆轉(zhuǎn)作用，并初步探討該中藥逆轉(zhuǎn)MDR的可能機(jī)制。 方法：選取經(jīng)典的耐藥細(xì)胞

2、系－人多藥耐藥K562/AO<,2>細(xì)胞株及相應(yīng)的敏感株K562，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測SCA對K562、K562/AO<,2>細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，從而選擇對兩株細(xì)胞的殺傷率均<10％的濃度作為該藥物的無毒劑量。以維拉帕米(VRP)為陽性對照，采用無毒劑量的SCA及VRP分別與阿霉素(ADM)共同作用于K562/AO<,2>、K562細(xì)胞株進(jìn)行MDR逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)；運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析SCA及VRP分別處理K5

3、62/AO<,2>細(xì)胞前后mdr1基因的表達(dá)水平；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)法分析SCA及VRP分別處理K562/AO<,2>、K562細(xì)胞前后，細(xì)胞Bcl-2、P-gP蚩白的表達(dá)水平，以及處理前后兩細(xì)胞內(nèi)ADM的平均熒光強(qiáng)度。 結(jié)果：1 MTT結(jié)果顯示：SCA在(0．05～10)μg/ml濃度范圍內(nèi)能抑制K562細(xì)胞和K562/AO<,2>細(xì)胞的體外增殖，且隨著濃度增加抑制率相應(yīng)升高，由回歸分析得出，當(dāng)SCA的終濃度<0.11μ

4、g/ml時，對兩細(xì)胞生長無明顯抑制作用，本實(shí)驗(yàn)選取0.1μg/ml作為無毒劑量。0.1μg/mlSCA及5μg/mlVRP<'[1]>分別作用K562/AO<,2>細(xì)胞后，對ADM的IC<,50>由(40.85±0.40)μg/ml 分別降至(27.09±0.63)μg/ml、(4.29±0.13)μg/ml，部分逆轉(zhuǎn)了K562/AO<,2>細(xì)胞對ADM的耐藥性，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.51倍和9.52倍，兩藥物逆轉(zhuǎn)程度比較，SCA作用較弱

5、，差異具有極顯著性(P<0.01)。2RT-PCR檢測結(jié)果顯示：K562/AO<,2>細(xì)胞高表達(dá)mdr1 mRNA，K562細(xì)胞不表達(dá)mdr1 mRNA，兩株細(xì)胞mdr1 mRNA的表達(dá)水平具有極顯著性差異(P<0.01)。SCA及VRP分別作用K562/AO<,2>細(xì)胞24h、48h、72h，mdr1 mRNA的表達(dá)均隨作用時間延長而逐漸降低，以72h表達(dá)最低，兩藥物比較無顯著性差異(P>0.05、)。3 FCM檢測結(jié)果顯示：K562

6、細(xì)胞膜表面不表達(dá)P-gp蛋白，K562/AO<,2>細(xì)胞膜表面P-gp蛋白表達(dá)量的相對值(FI)N 5.82±0.08，兩株細(xì)胞P-gp蛋白的表達(dá)具有極顯著性差異(P<0.01)；SCA作用K562/AO<,2>細(xì)胞24h、48h、72h，P-gp 蛋白表達(dá)量的FI值隨作用時間延長而逐漸降低，72hP-gp 表達(dá)最低為2.71±0.02；VRP作用相同時間后FI值降低更顯著，72h P-gp表達(dá)降為1.16±0.03，兩者均顯著降低P-

7、gp蛋白的表達(dá)，其中SCA降低P-gp蛋白表達(dá)程度不及VRP，差異具有極顯著性(P<0.01)。K562、K562/AO<,2>細(xì)胞均可檢測到Bcl+-2蛋白的表達(dá)，且在兩株細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；SCA及VRP分別作用K562細(xì)胞24h、48h、72h，Bcl-2表達(dá)量的FI值均隨作用時間延長而逐漸降低，72h Bcl-2表達(dá)最低；同一時間點(diǎn)兩藥物比較，作用24h時，SCA降低Bcl-2蛋白表達(dá)能力較VR

8、P強(qiáng)(P<0.01)，隨作用時間的延長，兩藥物降低Bcl-2蛋白表達(dá)能力無明顯差別(P>0.05)；SCA及VRP分別作用K562/AO<,2>細(xì)胞相同時間后，Bcl-2表達(dá)量的FI值隨作用時間延長而逐漸降低，72h表達(dá)最低，分別為1.59±0.05、1.67±0.08；兩藥物均降低K562/AO<,2>細(xì)胞 Bcl-2 蛋白的表達(dá)，兩者比較無明顯差異(P>0.05)。單獨(dú)應(yīng)用阿霉素處理K562/AO<,2>細(xì)胞，(選取30～120mi

9、n)細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的相對值(mode)為(31.01±0.79)～(44.81±1.51)，聯(lián)合SCA和VRP分別處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)阿霉素的mode值隨作用時間的延長而相應(yīng)的增加，具有時間依賴性。其中SCA增加細(xì)胞內(nèi)ADM的能力低于 VRP，兩者比較差異具有極顯著性(P<0.01)。 結(jié)論：1 斑蝥酸鈉在(0.05～10)μg/ml 濃度范圍內(nèi)，能抑制K562細(xì)胞和K562/AO<,2>細(xì)胞的體外增殖，并呈濃度依賴性。2 無毒

10、劑量的斑蝥酸鈉對K562/AO<,2>細(xì)胞阿霉素耐藥性體外有一定的逆轉(zhuǎn)作用，但較維拉帕米的逆轉(zhuǎn)作用明顯減弱。3可能的逆轉(zhuǎn)機(jī)制：①一定濃度的斑蝥酸鈉可能通過在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平抑制K562/AO<,2>細(xì)胞中mdr1mRNA、P-gp的表達(dá)，降低K562/AO<,2>細(xì)胞的耐藥性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥。②一定濃度的斑蝥酸鈉可能通過抑制P-gp藥物泵的泵出功能，提高細(xì)胞內(nèi)化療藥物的聚集，增加耐藥細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而有效殺傷