佐米曲坦對大鼠肝CYP3A1-2誘導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、本課題以報告基因法對佐米曲坦誘導(dǎo)大鼠肝CYP3A1/2的機(jī)制進(jìn)行了研究，考察了PXR在誘導(dǎo)過程中的作用。并在課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別考察了佐米曲坦對幼年SD大鼠肝CYP3A2蛋白表達(dá)量及活性的誘導(dǎo)，以研究佐米曲坦性別差異誘導(dǎo)成年大鼠肝CYP3A1/2的產(chǎn)生機(jī)制。
　　 目的:研究佐米曲坦誘導(dǎo)大鼠CYP3A1/2的機(jī)制并考察佐米曲坦對肝CYP3A2誘導(dǎo)作用隨給藥劑量的變化趨勢。
　　 方法:提取鼠肝總DNA，并以此為模板

2、進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到CYP3A1/2的啟動子序列。將這兩段序列分別連接至PMD18-T載體上并進(jìn)行DNA測序，選擇正確序列的DNA序列，與pGL3質(zhì)粒連接，得到pGL3-3Al promoter和pGL3-3A2promoter質(zhì)粒。將rPXR基因序列和PCDNA3.1載體連接構(gòu)建rPXR-PCDNA3.1質(zhì)粒。分別將pGL3-3A1/2 promoter質(zhì)粒與rPXR-PCDNA3.1、pRL-TK質(zhì)粒以一定的比例轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞。

3、加藥處理24h，通過檢測熒光強(qiáng)度考察藥物對CYP3A1/2啟動子序列的誘導(dǎo)作用。以經(jīng)典的誘導(dǎo)劑16α-氰基孕烯醇酮(PCN)作為陽性對照，空白溶劑(DMSO)作為陰性對照，觀察不同濃度佐米曲坦(10、50、100μmol·L-1)對大鼠肝CYP3A1/2的誘導(dǎo)作用。
　　 連續(xù)3天對不同性別的出生14天的幼鼠灌胃給藥1ml，制備微粒體。以20mg/200g地塞米松給藥組作為陽性對照組，空白溶劑CMC-Na組為陰性對照組，考察不同

4、劑量佐米曲坦(0.1、0.5和2.5mg/200g)對不同性別SD幼鼠肝CYP3A2的誘導(dǎo)作用。以Western Blot法考察微粒體中CYP3A2的蛋白表達(dá)量，以睪酮為底物檢測各微粒體中CYP3A的活性。連續(xù)3天對成年大鼠灌胃不同劑量的佐米曲坦(0.01，0.1，0.5，2.5，5和10mg/200g)，制備肝微粒體，以睪酮為底物檢測各微粒體中CYP3A的活性。以20mg/200g地塞米松給藥組作為陽性對照組，空白溶劑CMC-Na組為

5、陰性對照組。
　　 結(jié)果:報告基因?qū)嶒?yàn)中與陰性對照組相比，陽性對照組、佐米曲坦100μmol·L-1計量組，對肝CYP3A1有明顯的誘導(dǎo)作用，活性分別增加到1.93、1.96倍；陽性對照組、佐米曲坦10μmol·L-1、50μmol·L-1劑量組對肝CYP3A2有明顯的誘導(dǎo)作用，活性分別增加到2.51、2.10、1.63倍。佐米曲坦對雄性和雌性幼鼠的肝CYP3A2蛋白含量和活性均有誘導(dǎo)，且在中劑量(0.5mg/200g)和高劑量

6、(2.5mg/200g)時誘導(dǎo)明顯，對雄性幼鼠CYP3A活性的誘導(dǎo)倍數(shù)分別為2.20和1.85，對雌性幼鼠CYP3A活性的誘導(dǎo)倍數(shù)分別為1.71和1.55?？疾煲幌盗袆┝孔裘浊箤π坌源笫蟾蜟YP3A活性的誘導(dǎo)，在給藥劑量為0.5mg/200g時誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)倍數(shù)為1.46。
　　 結(jié)論: PXR通路是佐米曲坦誘導(dǎo)大鼠肝CYP3A1/2的一個重要途徑。佐米曲坦對成年雄性大鼠肝CYP3A的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于成年雌性大鼠，造成這一現(xiàn)象