淞江鱸(Trachidermus fasciatus Heckel)HSP70全序列的克隆及其表達(dá)的初步研究.pdf

1、淞江鱸（Trachidermus fasciatus Heckel），英文名：Roughskin sculpin，隸屬于鮋形目(Scorpaeniformes)，杜父魚科(Cottidae)，淞江鱸屬（Trachidermus）。歷史上淞江鱸分布區(qū)較廣，現(xiàn)在由于環(huán)境污染和人為捕撈等因素，淞江鱸賴以生存和繁衍的生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重的破壞，淞江鱸在我國許多水域大量減少已至絕跡。在這種情況下，我國首家淞江鱸自然保護(hù)區(qū)己在山東省文登市埠口設(shè)立。此外

2、，對(duì)淞江鱸進(jìn)行人工馴養(yǎng)與繁殖也已成功，并進(jìn)入規(guī)?；B(yǎng)殖階段。
　　當(dāng)今，為保證動(dòng)物可以在沒有痛苦的狀態(tài)下生活，福利養(yǎng)殖已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)話題。機(jī)體對(duì)外界或內(nèi)部各種刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和稱之為應(yīng)激，過強(qiáng)或過長的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生不利的影響。為了實(shí)現(xiàn)福利養(yǎng)殖和提高養(yǎng)殖效率，應(yīng)避免因不適的外界條件而引起應(yīng)激反應(yīng)。
　　熱應(yīng)激蛋白(HSPs)是一類存在于所有生物體包括魚類細(xì)胞內(nèi)比較保守的蛋白，在遇到外界刺激時(shí)，能誘導(dǎo)

3、或增強(qiáng)其表達(dá)，以保護(hù)細(xì)胞免受損害。目前根據(jù)分子量大小可以把HSPs分為：HSP90、HSP70和小分子量HSPs。HSP70作為分子伴侶在協(xié)助新生多肽鏈折疊，蛋白質(zhì)復(fù)合體的裝配，以及調(diào)節(jié)、修護(hù)和降解變性的蛋白質(zhì)方面起著重要作用。研究證明一些熱應(yīng)激蛋白可以作為指標(biāo)測定魚類的應(yīng)激狀態(tài)。魚體在受到外界環(huán)境因子脅迫時(shí)，會(huì)生成大量的熱應(yīng)激蛋白，這些因素包括工業(yè)處理水、重金屬離子、亞砷酸鹽及寄生蟲等環(huán)境因子。
　　作為一類存在于包括魚類在內(nèi)的

4、所有生物體細(xì)胞的蛋白，熱應(yīng)激蛋白在免疫學(xué)方面的應(yīng)用價(jià)值也正日益受到人們的關(guān)注。研究表明，人類的許多疾病與人體內(nèi)熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。由于熱應(yīng)激蛋白參與了生物的多種免疫應(yīng)答過程，因此，外界刺激誘導(dǎo)生物機(jī)體產(chǎn)生的熱應(yīng)激蛋白能夠增強(qiáng)生物對(duì)某些破壞性因子的抗性。一些熱應(yīng)激蛋白尤其是HSP70家族成員具有高度保守的序列以及在受到環(huán)境脅迫后能夠大量表達(dá)，因此，HSP70作為指標(biāo)來測定魚類的應(yīng)激狀態(tài)。
　　鑒于熱應(yīng)激蛋白在生物體免疫、抗病、

5、環(huán)境適應(yīng)等方面的重要性，本文根據(jù)鯉魚熱應(yīng)激蛋白70(Heat shock protein，HSP70)基因序列(AY120894)設(shè)計(jì)并合成引物，以淞江鱸肝臟組織總RNA為模板，獲得淞江鱸HSP70基因cDNA部分序列，長度為480bp，GeneBank登陸號(hào)為KC342053。根據(jù)已知序列，采用RACE技術(shù)克隆得到了熱應(yīng)激蛋白的cDNA全長，并進(jìn)行了序列分析。序列分析結(jié)果顯示此序列與紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）等有

6、較高的同源性。獲得淞江鱸cDNA全長2138bp，開放閱讀框1947bp，編碼了649個(gè)氨基酸。氨基酸同源比對(duì)表明，淞江鱸與其他已知魚類部分序列的同源性為82％-99％，與兩棲類、鳥類以及哺乳類的同源性為75％-86％。
　　為了研究HSP70是否可作為養(yǎng)殖中的應(yīng)激監(jiān)測分子指標(biāo)，應(yīng)用所獲淞江鱸HSP70基因部分序列，以淞江鱸β-actin基因的序列(HM449124)為內(nèi)參，利用熒光定量PCR技術(shù)，檢測25℃熱應(yīng)激狀態(tài)下HSP70

7、在淞江鱸肌肉、腸、腦、皮膚、性腺、肝臟、心臟、鰓、鰭9個(gè)組織的表達(dá)差異。結(jié)果表明，HSP70在淞江鱸9個(gè)組織中普遍表達(dá)，其中在鰭中表達(dá)量最高，在性腺、鰓、腦、肌肉、肝臟、皮膚、腸中的表達(dá)量依次遞減，在心臟中表達(dá)量最低。這可能跟淞江鱸物種特異性有關(guān)，也可能是由于25℃還沒有引起淞江鱸的強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)。但鰭中HSP70的表達(dá)量可能成為衡量淞江鱸應(yīng)激程度的指標(biāo)。此外，還通過熒光定量PCR平臺(tái)測得了8個(gè)器官或組織HSP70隨季節(jié)的變化，HSP7