五種蟲媒病毒的傳代和鑒定以及生物學(xué)性狀和分子生物學(xué)特征的研究.pdf

1、中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文五種蟲媒病毒的傳代和鑒定以及生物學(xué)性狀和分子生物學(xué)特征的研究姓名：彭文明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：黃如統(tǒng)2002.6.1五種蟲媒病毒的傳代鑒定及生物學(xué)與分子生物學(xué)性狀的研究 中文摘要清組。誣種蟲媒病毒的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，1 ～3 日齡乳鼠對(duì)這五種蟲媒病毒均敏感，但發(fā)病時(shí)間及癥狀有所不同。M A Y 發(fā)病時(shí)間約為1 ～2 d ，S F Vl d ，M V E3 d ，I L H2 d

2、，B U N1 ～2 d ．在細(xì)胞敏感性試驗(yàn)中，采用微量細(xì)胞培養(yǎng)方法測(cè)定病毒的滴度，將不同稀釋度的鼠腦懸液分別接種于L L C - M K ：、B H K z - 、C 6 ／3 6和^ ，．，細(xì)胞，從五種病毒在這4 株傳代細(xì)胞上出現(xiàn)C P E 的時(shí)間來看，以在B H K ：。細(xì)胞上出現(xiàn)的最早、一般為2 —3 天；C P E 最明顯，M A Y 和S F V 為融合C P E ，而且滴度普遍較高，都在6 ．5 以上．空斑試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的要求

3、較高，為了探索細(xì)胞培養(yǎng)的最佳條件，選擇血清含量、p H 值和卡那霉素濃度三個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的主要影響因素，按照L ，( 3 3 ) 正交設(shè)計(jì)對(duì)B H K ：，細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)。結(jié)果表明，在6 0 ％D M E M ，3 0 ％的0 ．5 ％水解乳蛋白，1 0 ％小牛血清，常量青、鏈霉素和5 0 ¨g ／m l 卡那霉素，保持p H7 ．2 條件下，B H K ：，細(xì)胞生長(zhǎng)最好，細(xì)胞單層能夠維持7 天以上．在該培養(yǎng)條件下，

4、五種病毒在B H K ，。細(xì)胞單層上于不同時(shí)間出現(xiàn)了形態(tài)、大小都不相同的空斑，最早出現(xiàn)空斑的時(shí)間為2 —3 天，最佳時(shí)間為3 ～4 天．其中SF V 出現(xiàn)了圓形直徑4 ．7 m m 的大空斑，M A Y 、IL H 和B u N 出現(xiàn)1 ．0 ～1 ．6 m m 的空斑，而M V E 僅為0 ．7 m m 的小空斑．隨后進(jìn)行了病毒的血凝試驗(yàn)，五種蟲媒病毒對(duì)鵝紅細(xì)胞的血凝最適p H 值分別為：M A Y 6 ．4 、S F V6 ．4 、

5、M V E7 ．0 、I L H6 ．6 和B U N6 ．4 。以上性狀均符合蟲媒病毒的生物學(xué)性質(zhì)．在生物學(xué)性狀研究的基礎(chǔ)上，本文又從分子生物學(xué)水平對(duì)這五種蟲媒病毒進(jìn)行了進(jìn)一步的研究．首先從乳鼠腦中提取病毒基因組R N A ，利用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( R T - P C R ) 技術(shù)進(jìn)行五種蟲煤病毒部分結(jié)構(gòu)區(qū)或非結(jié)構(gòu)區(qū)中保守基因片段的c D N A 擴(kuò)增，獲得的目的片段分別克隆于p G E M - T - E a s y 載體，挑