外源性一氧化碳對移植腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響及其機制的實驗研究.pdf

1、腎移植是腎功能衰竭患者的有效也是最終治療手段。目前移植腎的1年存活率已經(jīng)超過90%,但其長期生存率并沒有明顯改善,接近半數(shù)的移植患者在10年內(nèi)會出現(xiàn)移植腎纖維化和功能衰竭,這主要歸因于移植腎臟的慢性排斥反應(yīng)。盡管具體的分子和細胞機制尚不清楚,但目前可以肯定非免疫因素和免疫因素在慢性移植物功能障礙的發(fā)病機理中都起重要作用。
　　 腎臟慢性排斥反應(yīng)的主要病理特征是以實質(zhì)細胞進行性減少和細胞外基質(zhì)(ECM)的過度聚集為表現(xiàn)的腎臟纖維化

2、。ECM主要由成纖維細胞產(chǎn)生。過度表達的成纖維細胞來源于發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化的腎小管上皮細胞。腎小管上皮細胞在特定條件下發(fā)生形態(tài)和功能的改變,轉(zhuǎn)化為具有活動能力的間質(zhì)細胞,即所謂的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)。EMT的分子學(xué)表現(xiàn)為進行性的上皮細胞標(biāo)志物E-鈣粘素(E-cadherin)的表達下降和持續(xù)性的肌成纖維細胞標(biāo)志物α-SMA的表達升高。
　　 研究指出TGF-β1是

3、調(diào)控腎小管EMT的關(guān)鍵細胞因子,其作用包括抑制上皮細胞標(biāo)志物E.鈣粘素(E-cadherin)的表達、上調(diào)肌成纖維細胞標(biāo)志物α-SMA的表達,以及增加ECM的聚集等。但生理表達量的TGF-β1是一種強效的免疫抑制和抗炎因子,能顯著抑制急性排斥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受,阻斷其表達并不明智。研究指出,過量表達的TGF-β1相當(dāng)一部分來自于T細胞及單核-巨噬細胞浸潤,通過抑制免疫細胞浸潤這一過程必然限制腎小管EMT進展。
　　 血紅素加氧酶

4、-1(HO-1)被發(fā)現(xiàn)具有明確的抑制免疫細胞浸潤作用。其在體內(nèi)催化血紅素分解生成膽綠素、一氧化碳(carbonmonoxide,CO)和游離鐵,而CO在幾乎所有的損傷或疾病模型中部分甚至完全替代了HO-1所提供的保護作甩。因此,我們在此基礎(chǔ)上推測CO在腎移植背景下對免疫細胞具有確切的抑制功能。進一步推測CO對移植腎小管EMT可能有顯著的抑制或逆轉(zhuǎn)作用。
　　 目的：
　　 1.先期探索并優(yōu)化手術(shù)操作技術(shù),建立穩(wěn)定的DA-

5、WF大鼠移植腎動物模型。
　　 2.在已建立的移植腎模型基礎(chǔ)上,通過相關(guān)染色檢驗明確移植腎組織間質(zhì)纖維化的出現(xiàn),并證實移植腎臟中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的存在。
　　 3.應(yīng)用一氧化碳釋放分子CORM-2對DA-WF移植腎問質(zhì)纖維化模型進行干預(yù),以獲取課題試驗用組織標(biāo)本。
　　 4.通過對組織標(biāo)本的相關(guān)檢驗進一步研究CO是否通過抑制免疫細胞浸潤這一機制來抑制或逆轉(zhuǎn)移植腎EMT,進而顯著延緩移植腎纖維化進程。

6、>　　 方法：
　　 本課題分四部分進行:
　　 1.利用SD大鼠探索并優(yōu)化同種異體腎移植手術(shù)操作技術(shù)。水合氯醛麻醉大鼠,腹主動脈直接插管原位灌注的方式處理供腎,以供、受體腎臟同名血管端端吻合、輸尿管端端吻合的方式移植腎臟,受體自體腎采用“腎血管體外延遲結(jié)扎”方式處理。
　　 2.DarkAgouti(DA)(RT1av1)大鼠為供體,Wistar-Furth(WF)(Rtlu)大鼠為受體建立同種異體腎移植(D

7、A-WF)模型并標(biāo)記為實驗組,WF-WF大鼠腎移植做對照組。術(shù)前3d及術(shù)后2w內(nèi)WF受體大鼠接受10mg/kg/d的環(huán)孢素皮下注射。于術(shù)后第2w、4w、8w、12w測量大鼠體重并測血肌酐和尿素氮,動態(tài)監(jiān)測大鼠一般情況和腎功能變化。取第12w實驗組及對照組移植腎臟組織分別行H&E染色、Masson染色、E-cadherin免疫組化、α-SMA免疫組化。采用HPIAS-1000彩色病理圖像分析儀分析、SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。

8、>　　 3.建立DA-WF腎移植模型,隨機編號分為兩組,一組行CORM-2干預(yù),一組行iCORM-2干預(yù),WF-WF做空白參照。每組內(nèi)的大鼠選取固定數(shù)目在術(shù)后第2w、4w、8w、12w分別稱重并處死。留取處死受體大鼠移植‘腎組織及腔靜脈血。移植腎組織備行進一步實驗,腔靜脈血檢測血肌酐、尿素氮指標(biāo)進行分析。使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。
　　 4.將第2w、4w、8w、12w共四批次行CORM-2干預(yù),iCORM-2干預(yù)

9、及空白參照移的植腎組織標(biāo)本分別行H&E染色、Masson染色、E-cadherin免疫組化、α-SMA免疫組化、CD3免疫組化、CD163免疫組化。采用HPLAS-1000彩色病理圖像分析儀分析、SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過先期探索及練習(xí),基本掌握了建立大鼠腎移植模型的相關(guān)技術(shù),能基本保證模型的成活率。為課題實驗提供了技術(shù)支持及相關(guān)經(jīng)驗。
　　 2.通過建立并對比DA-WF、W

10、F-WF兩組腎移植模型的術(shù)后一般狀況、移植腎功能比較及第12w移植腎組織的HE染色、Masson染色和移植腎組織的E-cadherin和α-SMA的免疫組化染色證實DA-WF大鼠腎移植模型誘導(dǎo)了慢性排斥反應(yīng),出現(xiàn)了腎臟間質(zhì)纖維化改變,并且證實了移植腎臟模型中EMT的存在。
　　 3.在對CORM-2干預(yù),iCORM-2干預(yù)、空白參照三組大鼠腎移植模型的移植腎功能的檢測結(jié)果分析中可以證實一氧化碳釋放分子CORM-2可以抑制移植腎臟