rhTRAIL聯(lián)合As-,2-O-,3-治療胃癌的實驗研究.pdf

1、研究背景 細(xì)胞凋亡的異常減少是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征，因此促使腫瘤細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是治療腫瘤的有效手段。經(jīng)典的凋亡途徑包括：線粒體通路(內(nèi)源性途徑)和死亡受體通路(外源性途徑)，大多數(shù)抗癌藥物是通過上述途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮治療作用的。 腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor Necrosis Fac-tor-relatedApoptosis-indllcing Ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子家族新成

2、員，屬于Ⅱ型膜糖蛋白。它的細(xì)胞外部分被特定的酶降解后形成可溶性分子，能與靶細(xì)胞表面的死亡受體特異性結(jié)合誘導(dǎo)多種組織來源的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株及腫瘤細(xì)胞株凋亡，同時對正常細(xì)胞的影響較小，因而是廣受矚目的潛在的腫瘤治療手段。盡管在多項體內(nèi)外研究中展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景，但TRAIL作為抗癌藥物仍然面臨兩個問題：一方面，TRAIL仍然面臨著化療藥物普遍存在的耐藥性難題；另一方面，當(dāng)TRAIL超過一定濃度后，將喪失對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用，誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋

3、亡而帶來副作用。與此同時，越來越多的報道顯示，多種化療藥物可以增加腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性，在不增加毒性作用的前提下提高療效。因此，探索高效的TRAIL配伍使用方案具有重要的意義。 已有的研究表明：As<,2>O<,3>可以直接作用于線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔道(MPTP)蛋白質(zhì)巰基，促使線粒體電位下降，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。As<,2>O<,3>直接損傷線粒體從而啟動細(xì)胞凋亡程序的特點使其避開凋亡通路上線粒體上游的環(huán)節(jié)，減少了耐藥的

4、發(fā)生，因此對許多耐藥模型有效。 研究目的 研究As<,2>O<,3>與rhTRAIL這個配伍用藥方案對體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞生長與凋亡的影響，并研究其發(fā)生機制，旨在探索胃癌治療新方案。 研究方法 1 As<,2>O<,3>與rhTRAIL抗胃癌細(xì)胞SGC7901的協(xié)同作用 ①分別用梯度濃度的As<,2>O<,3>和rhTRAIL經(jīng)不同時間處理人胃癌SGC7901細(xì)胞； ②MTT法檢測細(xì)胞生長

5、抑制率，計算出兩藥的IC<,50>值； ③熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的變化(Hochest33258熒光染色和AO/EB雙熒光染色法)； ④瓊脂糖凝膠電泳分析腫瘤細(xì)胞內(nèi)生化指標(biāo)的變化，看是否有DNA ladder出現(xiàn)； ⑤用AnnexinV-FITC和PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)定量檢測細(xì)胞凋亡； ⑥分別用細(xì)胞毒性劑量(5μmol/L)和亞毒性劑量(lμmol/L)As<,2>O<,3>聯(lián)合rhTRAIL處理

6、SGC7901細(xì)胞，根據(jù)金正均方法判斷藥物相互作用效應(yīng)； 2 線粒體途徑參與rhTRAIL與As<,2>O<,3>誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡 ①DiOC6熒光染色流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞線粒體跨膜電位(△ψm)的變化； ②AnnexinV-FITC和PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡； ③比色法檢測各組細(xì)胞Caspase-8、9活性。 3 As<,2>O<,3>對SGC7901細(xì)胞TRAIL死亡

7、受體及cFLIP基因表達(dá)的影響 ①半定量RT-PCR和Western blot檢測As<,2>O<,3>處理前后TRAIL受體(DR<,4>，DR<,5>)和cFLIP(cFLIPL，cFLIPs)基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)； ②間接免疫熒光染色流式細(xì)胞術(shù)檢測As203處理前后SGC7901細(xì)胞表面TRAIL死亡受體的表達(dá)。 研究結(jié)果 1 As<,2>O<,3>與rhTRAIL抗胃癌細(xì)胞SGC790

8、1的協(xié)同作用 ①As<,2>O<,3>和rhTAIL單獨應(yīng)用均可以呈濃度和時間依賴性地抑制SGC7901細(xì)胞的生長，兩藥處理72h的IC<,50>分別為15.17μmol/L和384.35μg/L； ②As<,2>O<,3>和rhTRAIL單獨或聯(lián)合處理SGC7901細(xì)胞后，處理組部分細(xì)胞熒光顯微鏡下顯示凋亡細(xì)胞特有的染色質(zhì)變化征象； ③一定濃度的As<,2>O<,3>和rhTRAIL作用48 h后，提取細(xì)胞D

9、NA行瓊脂糖電泳分析，呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡時典型的DNA梯狀條帶； ④ Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)一定濃度范圍內(nèi)As<,2>O<,3>和rhTRAIL處理后，SGC7901細(xì)胞凋亡率顯著增加； ⑤5μmol/L(細(xì)胞毒性劑量)As<,2>O<,3>和200μg/LrhTRAIL聯(lián)合處理后，SGC7901細(xì)胞生長抑制率與凋亡率顯著升高，金正均方法分析表明兩藥聯(lián)用對細(xì)胞生長抑制、凋亡誘導(dǎo)有增強作用

10、： ⑥亞細(xì)胞毒性濃度(1μmol/L)As<,2>O<,3>增敏rhTRAIL對SGC7901細(xì)胞的生長抑制、凋亡誘導(dǎo)作用。 2 線粒體途徑參與rhTRAIL與As<,2>O<,3>誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡 ①As<,2>O<,3>與rhTRAIL均可以時間依賴性地導(dǎo)致SGC7901細(xì)胞線粒體跨膜電位下降，As<,2>O<,3>+TRAIL組SGC7901細(xì)胞△ψm下降程度大于單用任何一種藥物；

11、② rhTRAIL組細(xì)胞Caspase-8、9活性較對照組明顯升高；As<,2>O<,3>組細(xì)胞Caspase-9活性較對照組明顯升高； ③ caspase-8抑制劑Z-IETD-fmk部分拮抗rhTRAIL誘導(dǎo)的△ψm下降、Caspase-8、9活性升高與凋亡發(fā)生，而對As<,2>O<,3>的效應(yīng)無顯著影響； ④二硫鍵還原劑(DTT)部分拮抗As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的△ψm下降、Caspase-9活性升高與凋亡發(fā)

12、生，而對rhTRAIL的效應(yīng)無顯著影響。 3 As<,2>O<,3>對SGC7901細(xì)胞TRAIL死亡受體及cFLIP基因表達(dá)的影響 ①SGC7901細(xì)胞存在TRAIL受體(DR<,4>，DR<,5>)在mRNA、總蛋白質(zhì)以及細(xì)胞表面蛋白質(zhì)等水平的表達(dá)；As<,2>O<,3>(1μmol/L)與As<,2>O<,3>(5μmol/L)聯(lián)合rsTRML或單獨處理均可上調(diào)SGC7901細(xì)胞TRAIL受體(DR<,4>，DR<

13、,5>)在各個水平的表達(dá)； ②SGC7901細(xì)胞存在cFLIP(cFLIPL，cFLIPs)基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)；As<,2>O<,3>處理對cFLIP(cFLIPL，cFLIPs)基因mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平無影響。 研究結(jié)論 1 As<,2>O<,3>與rhTRAIL可以呈濃度、時間依賴性的抑制SGC7901細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡；不同濃度As<,2>O<,3>與rhTRAIL聯(lián)用均有協(xié)同抑制SG

14、C7901細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡的效應(yīng)。 2 As<,2>O<,3>通過破壞線粒體膜上蛋白質(zhì)巰基從而直接激活線粒體相關(guān)途徑誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡；rhTRAIL與受體結(jié)合后可能通過caspase-8間接激活線粒體途徑誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡；As<,2>O<,3>與rhTRAIL聯(lián)用時，各自通過不同途徑作用于SGC7901細(xì)胞線粒體，增加其跨膜電位的降低以及由此導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面形成協(xié)同作用。