珙桐DiMYB1基因的克隆、鑒定及功能研究.pdf

1、珙桐（Davidia involucrata Baill.）為珙桐科珙桐屬落葉喬木，第三紀(jì)古熱帶植物孑遺種，我國特有的珍稀植物，國家Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)瀕危物種，具有極高的觀賞價(jià)值和學(xué)術(shù)研究價(jià)值。本研究從珙桐果實(shí)及種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到一個(gè)編碼調(diào)控原花青素生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因DiMYB1，對其進(jìn)行了克隆及功能分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.珙桐DiMYB1基因的克隆及生物信息學(xué)分析。根據(jù)珙桐果實(shí)及種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中該基因的O

2、RF序列設(shè)計(jì)特異引物，以珙桐敗育種子的cDNA為模板進(jìn)行RCR擴(kuò)增得到全長序列，并在GenBank上登錄，登錄號為KR996175。利用在線軟件對該基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。
　　2.DiMYB1基因的表達(dá)模式。
　　①DiMYB1基因在珙桐芽、葉片、苞片、果肉、種子中的表達(dá)量qPCR分析。結(jié)果表明，DiMYB1基因在紫色幼葉中的表達(dá)量最高，其次是雄蕊，在芽、莖、成熟葉片、苞片、果肉和種子中微量表達(dá)。
　?、贒iM

3、YB1基因在正常和敗育種子中的表達(dá)模式。qPCR分析結(jié)果表明，DiMYB1基因在敗育種子中的表達(dá)量顯著高于正常種子，且在中期敗育種子中的表達(dá)量達(dá)到最高。
　?、跠iMYB1基因在不同顏色葉片中的表達(dá)。DiMYB1基因在紫色葉片中的相對表達(dá)量最高，其次是中間色（介于紫色和淡黃綠色之間）葉片，在綠色葉片中表達(dá)量較低。
　　3.珙桐DiMYB1基因的原核表達(dá)。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a(+)-DiMYBl，高效表達(dá)蛋白質(zhì)，采用H

4、is標(biāo)簽純化蛋白，DiMYB1蛋白以包涵體的形式存在。
　　4.珙桐DiMYB1基因功能在擬南芥中的初步驗(yàn)證。構(gòu)建植物超量表達(dá)載體pBI-121-DiMYB1，重組轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，采用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥花序，收獲種子后，通過抗性培養(yǎng)篩選陽性植株，自交繁殖2代后得到T2代轉(zhuǎn)基因植株。與野生型擬南芥相比，DiMYB1超量表達(dá)植株的主要表型差異表現(xiàn)在:大部分幼苗葉片顏色變紫;多數(shù)幼苗葉片的形態(tài)和數(shù)目發(fā)生了明顯變化，有的葉片