上皮性漿液性卵巢癌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女的生命和健康。漿液性卵巢癌是其中最主要的病理類型.目前卵巢癌的發(fā)病、轉(zhuǎn)移機理仍不清楚。近年來諸多研究提示，腫瘤是一種分子病，腫瘤的特異表現(xiàn)很可能是由深層次的基因改變造成的，而其產(chǎn)物——蛋白質(zhì)是細胞功能的最終執(zhí)行者，故本論文的目的在于，從蛋白質(zhì)表達水平的角度來探討卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制。首先，通過雙向電泳技術(shù)獲得了10例漿液性卵巢癌組織和10例正常卵巢上皮組織進行了總蛋白表達膠圖，用PDQUES

2、T軟件進行對比分析，找出在漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮組織中表達差異2倍以上并有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）的蛋白質(zhì)點.挖取并富集這些差異蛋白質(zhì)點進行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定。其次，選取了其中的6個蛋白質(zhì)：GGCT，GMFB，HDGF， Rho GDI2，BANF1，和Galectin-1，采用western blot的方法檢測它們在20例漿液性卵巢癌組織和20正常卵巢上皮組織中的表達情況，以檢驗雙向電泳及質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性。接

3、著，為了觀察相應(yīng)的基因表達情況，又采用了實時熒光定量RT-PCR的方法檢測了相應(yīng)的6個基因：GGCT，GMFB，HDGF，ARHGDIB，BANF1，和Galectin-1在同樣20例漿液性卵巢癌組織和20正常卵巢上皮組織中的表達情況。然后，選取了一個在人類腫瘤中研究較少的蛋白質(zhì)——GMFB，擴大樣本量，采用免疫組織化學(xué)的方法，檢測了其在245例各種不同程度的卵巢上皮性病變（44例正常卵巢上皮組織，51例良性漿液性囊腺瘤，40例交界性漿

4、液性腺瘤，110例漿液性卵巢癌）中的表達情況，分析了GMFB蛋白質(zhì)表達與漿液性卵巢癌臨床及組織病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，并采用了單因素和多因素模型的方法，進一步判斷了GMFB蛋白質(zhì)表達與漿液性卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系。最后，本研究基于RNAi干擾的方法，從細胞水平進一步探討了GMFB對漿液性卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響。本研究最終在每張膠圖上平均約分離到1800個蛋白質(zhì)點，找出63個差異表達的蛋白質(zhì)點，并成功鑒定到其中的61個，代表54個獨立的蛋

5、白質(zhì)。Western blot驗證表明相對于正常卵巢上皮組織，GGCT，GMFB，HDGF Rho GDI2在漿液性卵巢癌組織中表達上調(diào)（P<0.001），而BANF1，和Galectin-1在漿液性卵巢癌組織中表達下調(diào)（P<0.001），其表達變化趨勢與前期雙向電泳及質(zhì)譜結(jié)果完全吻合，一定程度上證實了前期工作的可靠性。與于正常卵巢上皮組織比較，HDGF和ARHGDIB基因在漿液性卵巢癌組織中表達上調(diào)（P<0.0001），BANF1和G

6、alectin-1基因在漿液性卵巢癌組織中表達下調(diào)（P<0.0001），它們的表達變化趨勢與蛋白質(zhì)表達變化趨勢相同；然而，GGCT和GMFB基因在正常卵巢上皮組織和漿液性卵巢癌組織中的表達未發(fā)現(xiàn)明顯差異。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GMFB蛋白質(zhì)在正常卵巢上皮組織及三種卵巢上皮性病變中表達有顯著差異（P<0.0001），且從正常卵巢上皮組織，到良性漿液性囊腺瘤，交界性漿液性腺瘤，再到漿液性卵巢癌，表達逐漸上調(diào)，并與漿液性卵巢癌患者的臨床分期相關(guān)（

7、P=0.012）。生存分析提示，GMFB與漿液性卵巢癌患者的總體生存率（P=0.003）和無瘤生存率（P=0.010）相關(guān)，而且多元回歸模型分析揭示GMFB是漿液性卵巢癌患者總體生存（P=0.006）和無瘤生存（P=0.026）的獨立預(yù)后因子。RNAi干擾技術(shù)成功沉默GMFB在SKOV3細胞株中的表達，基因沉默組腫瘤細胞增殖力明顯下降（P<0.05）?？傊?，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是發(fā)現(xiàn)及篩選腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的有力手段。GGCT，GMFB，HDGF

8、，Rho GDI2，BANF1，和Galectin-1等差異蛋白質(zhì)可能與漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，也可能是潛在的分子標(biāo)志物。GMFB可能通過促進細胞增殖而參與漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程，它同時也是一個新發(fā)現(xiàn)的漿液性卵巢癌獨立預(yù)后因子，還可能是潛在的有前途的腫瘤靶向治療靶點。
　　 第一部分：上皮性漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮組織中差異表達蛋白質(zhì)的分離和鑒定
　　 目的：
　　 分離和鑒定漿液性卵巢癌組織和正常卵

9、巢上皮組織之間差異表達的蛋白質(zhì)。
　　 方法：
　　 提取10例漿液性卵巢癌組織和10例正常卵巢上皮組織的總蛋白，利用雙向電泳技術(shù)進行蛋白分離，采用硝酸銀染色法進行凝膠染色，PDQUEST軟件分析電泳圖譜，找出在兩組中表達差異2倍以上并有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）的蛋白質(zhì)點。手工挖取并富集這些差異蛋白質(zhì)膠點，采用硝酸銀染色兼容的串聯(lián)質(zhì)譜方法，MALDI-TOF-TOF MS，對這些蛋白質(zhì)進行鑒定。
　　 結(jié)果：<

10、br>　　 共得到60張雙向電泳圖譜，每張約有1800個蛋白質(zhì)點，找到63個差異表達的蛋白質(zhì)點，成功鑒定出其中的61個，分別代表54個互不相同的蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)論：
　　 運用雙向電泳結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩選到的54個在正常卵巢上皮組織和漿液性卵巢癌組織中差異表達的蛋白質(zhì)可能與漿液性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是發(fā)現(xiàn)和篩選腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的有效手段。
　　 第二部分：部分差異表達蛋白質(zhì)的驗

11、證及其基因水平表達的研究
　　 目的：
　　 進一步檢驗其中6個蛋白質(zhì)，GGCT，GMFB，HDGF，Rho GDI2，BANF1，和Galectin-1，在正常卵巢上皮組織和漿液性卵巢癌組織中的差異表達情況，進而驗證雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)的準(zhǔn)確性；檢測相應(yīng)的6個基因在兩組組織中的表達情況，并與蛋白質(zhì)表達改變趨勢進行比較。
　　 方法：
　　 收集20例正常卵巢上皮新鮮組織和20例漿液性卵巢癌新鮮組織，分別提

12、取總蛋白和總RNA，Western blot方法檢測蛋白質(zhì)表達，real time RT-PCR方法檢測mRNA表達。
　　 結(jié)果：
　　 GGCT，GMFB，HDGF，Rho GDI2在漿液性卵巢癌組織中表達上調(diào)，BANF1和Galectin-1在漿液性卵巢癌組織中表達下調(diào)。HDGF， ARHGDIB基因在漿液性卵巢癌組織中表達上調(diào)，BANF1和Galectin-1基因在漿液性卵巢癌組織中表達下調(diào)，GGCT和GMFB在

13、漿液性卵巢癌組織和正常卵巢上皮組織中表達沒有顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、6個蛋白質(zhì)表達驗證結(jié)果與雙向電泳及質(zhì)譜結(jié)果完全相符，前期差異蛋白質(zhì)分離鑒定過程可信。
　　 2、HDGF，ARHGDIB，BANF1，Galectin-1基因表達變化趨勢與蛋白質(zhì)相同；GGC與GMFB基因水平?jīng)]有明顯變化，提示此兩種蛋白表達可能受翻譯或翻譯后水平機制的調(diào)控，
　　 第三部分：GMFB在漿液性卵巢腫瘤中的表達分析

14、及預(yù)后相關(guān)分析
　　 目的：
　　 擴大樣本量，檢測GMFB在卵巢上皮組織，良性漿液性囊腺瘤，交界性漿液性腺瘤及漿液性卵巢癌中的表達；分析GMFB與漿液性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)及生存率的關(guān)系。
　　 方法：
　　 制作44例正常卵巢上皮組織，51例良性漿液性囊腺瘤，40例交界性漿液性腺瘤，110例漿液性卵巢癌石蠟切片，收集該組漿液性卵巢癌患者的臨床病理資料及生存資料，采用免疫組織化學(xué)的方法檢測GMFB的表

15、達，采用多種統(tǒng)計學(xué)方法進行結(jié)果分析。
　　 結(jié)果：
　　 GMFB蛋白質(zhì)在正常卵巢上皮組織及三種卵巢上皮性病變中表達有顯著差異，且從正常卵巢上皮組織，到良性漿液性囊腺瘤，交界性漿液性腺瘤，再到漿液性卵巢癌，表達逐漸上調(diào)，并與漿液性卵巢癌患者的臨床分期相關(guān)。高GMFB表達與漿液性卵巢癌患者的低總體生存率和低無瘤生存率相關(guān)，多元回歸模型分析揭示GMFB是漿液性卵巢癌患者總體生存和無瘤生存（P=0.026）的獨立預(yù)后因子。

16、r>　　 結(jié)論：
　　 1、GMFB可能參與漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程。
　　 2、GMFB是漿液性卵巢癌獨立預(yù)后因子，還可能是潛在的的腫瘤分子標(biāo)志物和靶向治療靶點。
　　 第四部分：GMFB表達對SKOV3細胞株增殖的影響
　　 目的：
　　 探討GMFB對SKOV3細胞增殖力的影響，初步闡明GMFB在漿液性卵巢癌中的作用機制。
　　 方法：
　　 合成特異性的siRNA，轉(zhuǎn)染