卵巢癌紫杉醇耐藥與蛋白質(zhì)p-cofilin相關(guān)性的研究.pdf

1、研究背景和目的：卵巢癌是婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第三位，死亡率占第一位的惡性疾病。在滿(mǎn)意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上，輔助紫杉醇+順鉑為主聯(lián)合化療的治療策略雖然明顯改善了初治卵巢癌的預(yù)后，但是晚期卵巢癌的5年生存率仍然徘徊在15—20％左右?；熀竽[瘤原發(fā)或獲得性對(duì)化療藥物耐藥是治療失敗的主要原因之一。目前對(duì)腫瘤耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)已經(jīng)相對(duì)深入，但是對(duì)于臨床的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值卻十分有限。已知的耐藥相關(guān)基因在卵巢癌中的表達(dá)不能很好地預(yù)測(cè)腫瘤的耐藥性

2、和預(yù)后，mRNA的豐度與其相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平的表達(dá)具有不一致性可能是主要的原因之一。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為從蛋白質(zhì)表達(dá)水平深入研究卵巢癌化療耐藥問(wèn)題提供了可能性。 2003年，本課題組受北京協(xié)和醫(yī)院重點(diǎn)基金資助，開(kāi)展了卵巢癌耐藥相關(guān)蛋白的比較蛋白質(zhì)組分析，尋找耐藥相關(guān)候選蛋白的研究。在通過(guò)體外不同給藥方式誘導(dǎo)卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞株SKOV3，以及獲購(gòu)卵巢癌紫杉醇敏感和耐藥細(xì)胞株A2780的基礎(chǔ)上，采用雙向電泳技術(shù)(2—DE)，成功制備紫杉

3、醇化療敏感和耐藥細(xì)胞株的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找差異蛋白的表達(dá)，篩選獲得了高豐度的耐藥標(biāo)記物候選蛋白Cofilin。經(jīng)Western—blot驗(yàn)證，總Cofilin蛋白在卵巢癌紫杉醇敏感和耐藥的細(xì)胞間的表達(dá)無(wú)明顯差異，而磷酸化Cofilin(p—cofilin)的表達(dá)有顯著性差異。經(jīng)過(guò)對(duì)24例化療敏感患者與22例耐藥患者的卵巢上皮癌組織切片的免疫組化染色，結(jié)果表明，總Cofilin在兩組中的表達(dá)無(wú)明顯差別；但化療耐藥組

4、中磷酸化Cofilin的表達(dá)明顯高于化療敏感組。進(jìn)一步的功能研究也表明，候選蛋白Cofilin1可能與卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥相關(guān)。 Cofilin是actin(微絲)結(jié)合蛋白，控制actin的聚合和解聚。磷酸化cofilin是actin的失活形式，去磷酸化是活化形式。磷酸化和去磷酸化的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換是actin行使功能的前提。Actin和紫杉醇的作用靶點(diǎn)tubulin(微管)均是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分。細(xì)胞骨架的功能主要參與細(xì)胞形態(tài)的

5、維持，參與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞的分裂，參與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和收縮，參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討候選蛋白Cofilin的磷酸化過(guò)程與紫杉醇作用及耐藥的相關(guān)性。通過(guò)分析Cofilin在體內(nèi)行使功能與紫杉醇抗腫瘤細(xì)胞機(jī)制的契合點(diǎn)，探討應(yīng)用細(xì)胞周期同步化的方法使耐藥細(xì)胞更多的集中在S期，并同步進(jìn)入M期，以增強(qiáng)紫杉醇的抗腫瘤效果，改善細(xì)胞的耐藥性。 研究?jī)?nèi)容及方法： 1、卵巢癌SKOV3、A278

6、0紫杉醇敏感和耐藥細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性比較。通過(guò)復(fù)蘇培養(yǎng)已成功誘導(dǎo)三年的卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞系SKOV3/TJ2500和A2780/TA2780，采用MTT法，觀察其耐藥性的維持。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、以及生長(zhǎng)周期進(jìn)行檢測(cè)。 2、針對(duì)卵巢癌耐紫杉醇細(xì)胞系體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)的特性，采用無(wú)血清培養(yǎng)法，將紫杉醇敏感和耐藥的四種細(xì)胞系細(xì)胞饑餓培養(yǎng)48小時(shí)之后，以不同濃度的紫杉醇作用，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞的蛋白質(zhì)，以W

7、estern—blot法檢測(cè)，觀察去除血清里外源性因素對(duì)p—cofilin影響后，紫杉醇對(duì)細(xì)胞自身p—cofilin表達(dá)的影響。 3、卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)候選蛋白p—cofilin的功能研究。應(yīng)用真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將含正義cofilin序列的質(zhì)粒和cofilin磷酸化位點(diǎn)S用D取代構(gòu)建質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染紫杉醇敏感細(xì)胞A2780后，Westernblot檢測(cè)p—cofilin和總cofilin的表達(dá)情況；MTT法檢測(cè)耐藥性的改變。

8、 4、紫杉醇敏感及耐藥細(xì)胞周期的同步化對(duì)紫杉醇?xì)饔糜绊懙难芯?。將紫杉醇敏感和耐藥?xì)胞用脫氧胸腺嘧啶核苷處理后，分別加入不同濃度梯度紫杉醇，在用藥后不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化。以不經(jīng)同步化處理的細(xì)胞為對(duì)照，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的的情況。 研究結(jié)果： 1、MTT法測(cè)定的結(jié)果顯示，紫杉醇敏感細(xì)胞系SKOV3和A2780的耐藥指數(shù)為1，SKOV3和A2780耐紫杉醇

9、細(xì)胞系TJ2500與TA2780的耐藥指數(shù)分別為62.35±11.3和25±6.5。姬姆薩—瑞氏染色的結(jié)果提示，耐藥細(xì)胞TJ2500的多核和畸形核細(xì)胞較敏感細(xì)胞SKOV3常見(jiàn)。而耐藥細(xì)胞TA2780形態(tài)上改變明顯，細(xì)胞大部分呈梭形，敏感細(xì)胞A2780呈圓形。細(xì)胞生長(zhǎng)周期的結(jié)果提示兩種耐藥細(xì)胞的群體倍增時(shí)間均延長(zhǎng)。耐藥細(xì)胞周期中G0-G1期細(xì)胞比率均增加，S期比率減少，差異顯著，M期細(xì)胞比率變化不大。 2、采用無(wú)血清培養(yǎng)法將紫杉醇

10、敏感和耐藥的細(xì)胞饑餓培養(yǎng)48小時(shí)后，以不同濃度的紫杉醇作用，在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)的結(jié)果表明，紫杉醇敏感和耐藥的細(xì)胞系均有較高水平的內(nèi)源性p—cofilin的表達(dá)。在經(jīng)不同濃度的紫杉醇作用后，在一定的時(shí)間點(diǎn)，紫杉醇敏感細(xì)胞的內(nèi)源性p—cofilin表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)；隨著藥物濃度的增加，下調(diào)的時(shí)間有所延長(zhǎng)。而紫杉醇耐藥的細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的紫杉醇作用后，內(nèi)源性p—cofilin的表達(dá)無(wú)明顯變化。 3、卵巢癌紫

11、杉醇敏感細(xì)胞A2780轉(zhuǎn)染正義cofilin質(zhì)粒后，cofilin及p—cofilin的表達(dá)均上調(diào)。MTT檢測(cè)的結(jié)果表明，與親本細(xì)胞相比，耐藥指數(shù)由1上升至11.5～11.8。A2780轉(zhuǎn)染cofilin磷酸化位點(diǎn)替代S3D質(zhì)粒后，p—cofilin的表達(dá)略有下調(diào)。與親本細(xì)胞相比，耐藥指數(shù)由1下降為0.1～0.16。 4、低濃度紫杉醇10nmol/l和高濃度100nmol/l用藥24小時(shí)對(duì)細(xì)胞周期G2/M期阻滯的影響在SKOV3

12、、A2780中有顯著性差異。100nmol/l和1000nmol/l之間的差異不顯著。相同濃度紫杉醇隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)G2/M期的阻滯作用增加，以用藥后24小時(shí)最顯著。敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞周期同步化處理后加入紫杉醇，短時(shí)間內(nèi)撤藥，其凋亡率敏感和耐藥細(xì)胞均較對(duì)照組增高，以48小時(shí)檢測(cè)結(jié)果差異最顯著。 研究結(jié)論： 1、卵巢癌紫杉醇敏感及耐藥細(xì)胞系SKOV3和A2780經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)，與本課題前期研究的細(xì)胞相比，生物學(xué)特征

13、無(wú)明顯的改變。在誘導(dǎo)耐紫杉醇三年后，MTT法測(cè)定的結(jié)果顯示，SKOV3和A2780耐紫杉醇細(xì)胞系TJ2500與TA2780的耐藥指數(shù)分別為62.35±11.3和25±6.5。耐藥指數(shù)較三年前雖有所下降，但仍良好地維持了其耐紫杉醇的特性。 2、采用無(wú)血清培養(yǎng)法將紫杉醇敏感和耐藥的細(xì)胞SKOV3/TJ2500與A278/TA2780饑餓培養(yǎng)48小時(shí)后，四種細(xì)胞均有較高水平的內(nèi)源性p—cofilin表達(dá)。在經(jīng)不同濃度的紫杉醇作用后，紫

14、杉醇敏感細(xì)胞的內(nèi)源性p—cofilin的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)；而耐藥的細(xì)胞內(nèi)源性p—cofilin的表達(dá)無(wú)明顯變化。由于磷酸化cofilin是actin的失活形式，去磷酸化是其活化形式，磷酸化和去磷酸化的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換是actin行使功能的前提。紫杉醇敏感細(xì)胞在藥物作用后內(nèi)源性p—cofilin的表達(dá)下調(diào)，在細(xì)胞總cofilin不變的情況下，意味著更多的cofilin轉(zhuǎn)化成為其活化的形式，驅(qū)動(dòng)actin行使功能，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，有利于化療藥物發(fā)揮抗腫

15、瘤的作用。耐藥的細(xì)胞在藥物作用后，始終維持內(nèi)源性p—cofilin的高表達(dá)，間接證明了其與卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的相關(guān)性。 3、卵巢癌紫杉醇敏感細(xì)胞A2780轉(zhuǎn)染正義cofilin質(zhì)粒后，cofilin及p—cofilin的表達(dá)均上調(diào)，細(xì)胞的耐藥指數(shù)上升至。A2780轉(zhuǎn)染cofilin磷酸化位點(diǎn)替代S3D質(zhì)粒后，p—cofilin的表達(dá)略有下調(diào)，耐藥指數(shù)下降。進(jìn)一步證明了p—cofilin的表達(dá)增高與卵巢癌對(duì)紫杉醇耐藥相關(guān)。

16、 4、在一定濃度范圍內(nèi)，紫杉醇的作用隨藥物濃度的增加而提高，達(dá)到一定濃度后，這種遞增效應(yīng)減弱或消失，說(shuō)明紫杉醇作用濃度有飽和效應(yīng)。其G2/M期阻滯作用隨用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，以用藥24小時(shí)最顯著。在紫杉醇有效濃度范圍內(nèi)，適當(dāng)延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間可能會(huì)減少耐藥性的產(chǎn)生或可成為逆轉(zhuǎn)耐藥的方法之一。但耐藥細(xì)胞的倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)，需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能提高紫杉醇的效果。細(xì)胞周期同步化方法有可能成為減少紫杉醇用藥時(shí)間，加強(qiáng)紫杉醇的作用效果以及逆轉(zhuǎn)耐