上皮性卵巢癌的發(fā)生及早期診斷研究.pdf

1、[研究背景與目的]
　　 卵巢癌是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。由于缺乏有效的早期篩查手段,早期癥狀及臨床表現(xiàn)不典型,約85％的患者初診時(shí)已屬疾病晚期。上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC),是卵巢癌中最常見類型,也是婦科腫瘤中死亡率最高的腫瘤類型,其死亡率高于其他所有婦科腫瘤之和。因?yàn)橹饕性缙诤Y查手段缺乏,早期診斷治療對(duì)于延長(zhǎng)患者生存時(shí)間是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié),但是卵巢癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)

2、制仍是未解之謎,給卵巢腫瘤的早期診斷帶來困難和挑戰(zhàn)。上皮性卵巢癌中又以卵巢高分化漿液性乳頭狀癌是常見的病理類型,普遍認(rèn)為這種類型有部分起源于卵巢表面上皮細(xì)胞。然而,到目前為止,還沒有任何直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明卵巢表面上皮細(xì)胞能夠形成高分化漿液性乳頭狀癌。研究表明,人卵巢惡性腫瘤的組織學(xué)類型分化是受多種因素影響的,包括上皮細(xì)胞一系列基因型和表現(xiàn)型的改變,可歸納為多種因素共同產(chǎn)生的生物學(xué)現(xiàn)象。探索卵巢癌的發(fā)生機(jī)制具有深遠(yuǎn)的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

3、　　 HER2/neu基因是一種原癌基因,位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上,編碼185 KD跨膜蛋白,具有酪氨酸激酶活性,屬于人類表皮生長(zhǎng)因子受體家族。以往對(duì)于HER2/neu基因的研究,主要集中于對(duì)乳腺癌的診斷、預(yù)后及靶向治療的效果,而在上皮性卵巢癌中研究較少。研究表明,HER2/neu基因擴(kuò)增及蛋白的過度表達(dá)與卵巢癌的預(yù)后及治療有密切聯(lián)系。25-30％的乳腺癌和卵巢癌中發(fā)現(xiàn)HER2/neu基因擴(kuò)增及蛋白的過度表達(dá),并被認(rèn)為是與預(yù)后不良相關(guān)的

4、因素,HER2/neu基因通過多種機(jī)制參與卵巢癌的演進(jìn),HER2/neu蛋白高表達(dá)與卵巢癌的多種臨床特征相關(guān),如臨床分期較晚、手術(shù)中發(fā)現(xiàn)巨大腫塊幾率高、病理學(xué)分化差、較高復(fù)發(fā)率、生存時(shí)間短和對(duì)以鉑類藥為主的化療不敏感。
　　 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移的能力。其主要特征為上皮表型缺失和間質(zhì)表型獲

5、得。EMT在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移以及多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要的作用,研究發(fā)現(xiàn),上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是細(xì)胞發(fā)生分子轉(zhuǎn)換,失去上皮特性而獲得間質(zhì)特性,繼而具備運(yùn)動(dòng)性以掙脫細(xì)胞間黏附,并侵犯到其他部位的過程。此外,腫瘤微環(huán)境通過特異因子的作用影響著腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　 為了探討HER2/neu基因過表達(dá)對(duì)卵巢上皮性腫瘤(Epithelial ovarian cancer,EOC)形成的作用,以及基因作用對(duì)上皮性卵巢癌生成的意

6、義；進(jìn)一步揭示腫瘤發(fā)生過程中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT)以及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境(Tumor Microenvironment)的影響。本文進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究:1.建立遺傳背景明確的過表達(dá)HER2/neu基因的T29Nt、T80Nt卵巢癌細(xì)胞模型。2.建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,揭示遺傳成分與腹膜腔微環(huán)境共同誘導(dǎo)作用對(duì)正常人類卵巢表面上皮向卵巢惡性腫瘤轉(zhuǎn)化過程的影響。3.觀察并

7、檢測(cè)腫瘤生物學(xué)特性,為更多的卵巢腫瘤研究建立可靠穩(wěn)定的腫瘤細(xì)胞模型,為臨床卵巢惡性腫瘤的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 [研究目的]
　　 構(gòu)建表達(dá)HER2/neu基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒,將逆轉(zhuǎn)錄病毒感染兩個(gè)永生化的人卵巢上皮腫瘤前細(xì)胞系T29、T80,經(jīng)過藥物篩選獲得穩(wěn)定過表達(dá)HER2/neu基因的T29N、T80N永生化細(xì)胞系。觀察穩(wěn)定過表達(dá)HER2/neu基因的T29N、T80N細(xì)胞株形態(tài)特征,并通過軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢

8、測(cè)細(xì)胞進(jìn)行活體外探測(cè)評(píng)價(jià)和定量分析細(xì)胞純系化集落生長(zhǎng)的潛力和生物學(xué)特性。
　　 [研究方法]
　　 1.將帶有HER2/neu基因的pBabe-HER2/neu-neomycin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Phoenixamphotropic包裝細(xì)胞,獲得帶有目的基因的重組載體病毒上清。
　　 2.用帶HER2/neu基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染兩個(gè)永生化的人類卵巢表面上皮腫瘤前細(xì)胞系T29和T80,T29和T80為本實(shí)驗(yàn)室通過將SV40

9、T/t抗原和hTERT轉(zhuǎn)染至人類卵巢表皮細(xì)胞系IOSE29和IOSE80中而獲得的永生化細(xì)胞系。感染細(xì)胞恢復(fù)后經(jīng)新霉素篩選,分別得到穩(wěn)定過表達(dá)HER2/neu基因的T29N和T80N兩個(gè)永生化細(xì)胞系。
　　 3.倒置顯微鏡下觀察T29、T80、T29N、T80N活細(xì)胞形態(tài)特征,并比較不同細(xì)胞系之間、子代細(xì)胞系與親代細(xì)胞系之間的細(xì)胞表型差異。
　　 4.采用Western-blot印跡蛋白檢測(cè)技術(shù),驗(yàn)證HER2/neu蛋白

10、在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后細(xì)胞系T29N、T80N與親代細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞間表達(dá)的差異。
　　 5.應(yīng)用軟瓊脂實(shí)驗(yàn)方法,取同代T29、T80、T29N、T80N細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),進(jìn)行活體外探測(cè)評(píng)價(jià)和定量分析細(xì)胞純系化集落生長(zhǎng)的潛力。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.帶有HER2/neu基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞,產(chǎn)生病毒上清感染T29、T80細(xì)胞系,獲得T29N、T80N
　　 經(jīng)過pBabe-HER2/neu-neomyc

11、in質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Phoenix amphotropic包裝細(xì)胞,培養(yǎng)產(chǎn)病毒細(xì)胞系,獲得帶有HER2/neu基因的病毒上清。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo),將HER2/neu基因?qū)氲絋29和T80中,用新霉素篩選獲得含建立HER2/neu cDNA的純化系,分別命名為T29N和T80N細(xì)胞系。
　　 2.親代細(xì)胞與T29N、T80N細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征
　　 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)活細(xì)胞形態(tài)分別為:T29細(xì)胞與親本細(xì)胞IOSE29一樣具有

12、間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,細(xì)胞呈現(xiàn):細(xì)胞間隙略大,稍稍分離,細(xì)胞成短梭形類似成纖維細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。而T80細(xì)胞與親本細(xì)胞IOSE80一樣具有上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,顯微鏡下觀察,細(xì)胞呈現(xiàn):細(xì)胞核圓形或橢圓形,位于細(xì)胞中央或稍偏位,染色質(zhì)細(xì)致均勻,為較典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。T29N和T80N細(xì)胞都呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞核圓形或橢圓形,位于細(xì)胞中央或稍偏位,染色質(zhì)增粗不均勻。
　　 3.T29N和T80N細(xì)胞系中HER2/neu蛋白表達(dá)<

13、br>　　 通過Western-blot蛋白印跡檢測(cè),以HER2/neu蛋白高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞SKOV3為對(duì)照,T29和T80細(xì)胞系為HER2/neu低表達(dá),T29N和T80N細(xì)胞系獲得穩(wěn)定HER2/neu蛋白過表達(dá)。其中β-actin為內(nèi)參照,比較加樣總蛋白的量。
　　 4.體外細(xì)胞形成集落能力的差異
　　 取同代的過表達(dá)HER2/neu基因的T29N和T80N細(xì)胞與T29、T80細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)H

14、ER2/neu的T29N、T80N細(xì)胞株比T29、T80細(xì)胞具有更強(qiáng)的集落形成能力,生成的集落數(shù)約為3倍。
　　 [結(jié)論]
　　 1.成功構(gòu)建帶有HER2/neu基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒,并通過病毒感染獲得穩(wěn)定過表達(dá)HER2/neu的T29N、T80N永生化細(xì)胞株。
　　 2.T29N細(xì)胞呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞形態(tài),T80N細(xì)胞為上皮細(xì)胞形態(tài)。
　　 3.過表達(dá)HER2/neu的T29N、T80N株純系化細(xì)胞比T29、T8

15、0細(xì)胞具有更強(qiáng)的集落形成能力。
　　 [研究目的]
　　 分別將T29、T80、T29N、T80N細(xì)胞接種到裸鼠的皮下及腹膜腔內(nèi),比較這些細(xì)胞系在異種動(dòng)物體內(nèi)成瘤性及腫瘤生長(zhǎng)速度。觀察移植瘤細(xì)胞T29Nt和T80Nt的形態(tài)學(xué)特征,并將移植瘤細(xì)胞T29Nt和T80Nt再次接種到裸鼠皮下和腹膜腔內(nèi)。觀察生成的移植瘤的病理學(xué)特征,并檢測(cè)新生腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　 [研究方法]
　　 1.裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn),取對(duì)數(shù)

16、生長(zhǎng)期的T29,T80,T29N,T80N細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基配制,分別取5×106個(gè)T29,T80,T29N,T80N細(xì)胞接種于4-6周齡雌性裸鼠皮下,每只兩點(diǎn),每2天觀察一次裸鼠,觀察腫瘤出現(xiàn)的時(shí)間和腫瘤的大小,測(cè)量腫瘤體積,繪出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。皮下移植瘤直徑達(dá)到1.5cm時(shí),處死裸鼠,切取腫瘤組織,繼續(xù)培養(yǎng)移植瘤細(xì)胞T29Nt和T80Nt,剩余組織以中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色。
　　 2.分別取5×106個(gè)T2

17、9,T80,T29N,T80N細(xì)胞接種于4-6周齡雌性裸鼠腹膜腔內(nèi)接種。腹膜腔內(nèi)細(xì)胞移植的裸鼠觀察6個(gè)月后處理。
　　 3.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基配制,取5×106個(gè)T29Nt,T80Nt細(xì)胞分別接種于4-6周齡雌性裸鼠皮下,每只兩點(diǎn)；取5×106個(gè)T29Nt,T80Nt細(xì)胞分別接種于4-6周齡雌性裸鼠腹膜腔內(nèi)。觀察6個(gè)月后,處死實(shí)驗(yàn)裸鼠后,切取皮下移植瘤及腹腔移植瘤組織以中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,HE染色,觀