游離脂肪酸通過Ca2+-calpain-2途徑誘導(dǎo)β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、β細(xì)胞功能損害是2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus,T2DM)發(fā)病的主要特征之一。肥胖與T2DM都與升高的游離脂肪酸(Free fatty acids,FFA)水平有關(guān)。但是, FFA造成β細(xì)胞功能損害的分子機(jī)制尚不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的標(biāo)志性分子grp78和ERS誘導(dǎo)的凋亡因子CHOP的表達(dá)隨著FFA對(duì)β細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)而呈時(shí)

2、間依賴性的增加。FFA作用β細(xì)胞后,作為觸發(fā)ERS的3個(gè)信號(hào)分子:ATF6、磷酸化的PERK和磷酸化的IRE1,它們的表達(dá)水平也顯著增加。故我們證實(shí)了FFA能夠誘導(dǎo)β細(xì)胞的ERS。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn),FFA能夠促進(jìn)STIM1和Orai1的結(jié)合以增加庫容性的Ca2+內(nèi)流,從而誘導(dǎo)ERS的發(fā)生。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)calpain-2分子參與了FFA誘導(dǎo)的CHOP的表達(dá)并誘導(dǎo)了caspase12和caspase3的激活,通過這些分子信號(hào)促進(jìn)了β細(xì)胞的

3、凋亡。綜上所述, Ca2+/calpain2通路在調(diào)節(jié)FFA誘導(dǎo)的β細(xì)胞ERS和凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。本實(shí)驗(yàn)分為四個(gè)部分:
　　第一部分:游離脂肪酸誘發(fā)β-TC3細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的研究
　　為了檢測(cè)FFA是否可以誘導(dǎo)β-TC3細(xì)胞的ERS,我們觀察了ERS相關(guān)標(biāo)志性分子的表達(dá)。ERS關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子有分子伴侶Grp78(也被稱為Bip)和轉(zhuǎn)錄因子CHOP。在實(shí)驗(yàn)中,β-TC3細(xì)胞用0.5mM的FFA或者牛血清白蛋白(Bo

4、vine serum albumin, BSA)分別處理0、8、16和24小時(shí),然后兩組之間進(jìn)行對(duì)比觀察。結(jié)果顯示,相對(duì)于BSA處理過的β-TC3細(xì)胞而言,在FFA處理過的細(xì)胞中,Grp78和CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性的增長(zhǎng)(P<0.05)。
　　為了進(jìn)一步評(píng)估FFA是否能夠誘導(dǎo)β-TC3細(xì)胞的ERS,我們檢測(cè)了ATF6, PERK和IRE1這3個(gè)參與ERS過程的重要信號(hào)分子的表達(dá)和

5、磷酸化水平。我們觀察到在FFA處理16小時(shí)后,β-TC3細(xì)胞ATF6、磷酸化的PERK和磷酸化的IRE1的表達(dá)與BSA處理組相比均顯著增加(P<0.05)。
　　上述的結(jié)果表明,FFA可以誘導(dǎo)β-TC3細(xì)胞的ERS。
　　由于 ERS可能是細(xì)胞死亡的一個(gè)中間環(huán)節(jié),所以我們用 annexin V/propidium iodide(PI)雙標(biāo)染色法在FFA處理β-TC3細(xì)胞后,檢測(cè)了細(xì)胞的凋亡程度。結(jié)果顯示, FFA處理過的細(xì)胞

6、凋亡水平較BSA處理過的細(xì)胞凋亡水平明顯增加(P<0.05)。
　　已知鼠源caspase-12的激活同ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)。因此,我們還觀察了β-TC3細(xì)胞caspase-12的活性水平。我們發(fā)現(xiàn),在FFA處理過的β細(xì)胞中,caspase-12的激活水平與BSA處理組相比顯著增加(P<0.05)。
　　已知,在哺乳動(dòng)物中,caspase-3(也被稱為CPP32, apopain或者YAMA)被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵的

7、中間分子。故我們進(jìn)一步檢測(cè)了caspase-3的激活情況。我們觀察到在 FFA處理過的細(xì)胞中,caspase-3的激活水平與 BSA處理組相比顯著提高(P<0.05)。
　　從以上所有的結(jié)果可以得出,FFA可以成功地誘導(dǎo)β-TC3細(xì)胞的ERS和凋亡。第二部分:庫容性Ca2+內(nèi)流參與游離脂肪酸誘發(fā)β-TC3細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究
　　已知打破細(xì)胞內(nèi)的Ca2+平衡能夠干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能并誘導(dǎo)細(xì)胞 ERS。在例如胰腺β-TC3細(xì)胞這樣

8、的非興奮性細(xì)胞中,Ca2+內(nèi)流是維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的主要機(jī)制。為了檢測(cè)在β-TC3細(xì)胞中,FFA誘導(dǎo)的ERS是否由Ca2+內(nèi)流變化引起,我們應(yīng)用了一種Ca2+通道阻滯劑NiCl2來處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在加入NiCl2處理細(xì)胞后, FFA并不能夠增加Grp78和CHOP的表達(dá)水平(P<0.05)。這個(gè)結(jié)果能夠說明FFA誘導(dǎo)的β細(xì)胞ERS是由Ca2+內(nèi)流調(diào)節(jié)的。
　　已知細(xì)胞內(nèi) Ca2+內(nèi)流的一條主要途徑是通過庫容性 Ca2+

9、通道。為了進(jìn)一步證實(shí)在β-TC3細(xì)胞中,FFA誘導(dǎo)的ERS是否由庫容性Ca2+內(nèi)流變化引起,在FFA處理過的細(xì)胞中,我們檢測(cè)了庫容性Ca2+內(nèi)流的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,FFA處理過的β-TC3細(xì)胞,其庫容性Ca2+內(nèi)流水平是BSA處理組的兩倍有余(P<0.05)。
　　近來的一些研究發(fā)現(xiàn),STIM1和Orai1這兩個(gè)分子與庫容性Ca2+內(nèi)流密切相關(guān)。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在FFA處理組和BSA處理組之間,STIM1和Orai1的總表達(dá)量

10、相當(dāng)(P>0.05)。然而,免疫共沉淀結(jié)果顯示,在 FFA處理組中,STIM1和 Orai1的結(jié)合明顯多于在BSA處理組中兩者的結(jié)合(P<0.05)。這些結(jié)果顯示,在β-TC3細(xì)胞中,FFA增強(qiáng)了STIM1和Orai1的結(jié)合。
　　因此,上述結(jié)果說明FFA誘導(dǎo)的β細(xì)胞ERS是由庫容性Ca2+內(nèi)流的變化引起的,而庫容性Ca2+內(nèi)流是由STIM1和Orai1的結(jié)合調(diào)控的。
　　第三部分:calpain-2參與游離脂肪酸促進(jìn)β-T

11、C3細(xì)胞CHOP表達(dá)的研究
　　Calpain-2是一個(gè)中性的Ca2+依賴的蛋白酶。它介導(dǎo)了很多的生理性功能,例如細(xì)胞骨架重塑,細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸以及細(xì)胞膜融合等。在β-TC3細(xì)胞中,為了評(píng)估FFA是否影響了calpain-2的活性,我們檢測(cè)了FFA處理過的β細(xì)胞中calpain-2的活性。結(jié)果顯示,FFA處理過的β-TC3細(xì)胞中的calpain-2活性與BSA處理組相比顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　為了檢測(cè)FFA誘導(dǎo)的β-T

12、C3細(xì)胞ERS是否與calpain-2分子相關(guān),我們?cè)O(shè)計(jì)了小干涉 RNA(Small interfering RNA,siRNA)來下調(diào) calpain-2的表達(dá)?？梢钥吹絚alpain-2的siRNA可以顯著地降低其蛋白和mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。
　　我們還可以觀察到,當(dāng)β-TC3細(xì)胞接受siRNA處理后,相對(duì)于BSA處理過的細(xì)胞而言,FFA處理過的細(xì)胞中的calpain-2活性并沒有顯著的增加(P>0.05)。

13、>　　為了進(jìn)一步證實(shí)calpain-2是否參與了FFA誘導(dǎo)的ERS,當(dāng)采用calpain-2 siRNA處理抑制β-TC3細(xì)胞的calpain-2活性后,我們檢測(cè)了Grp78和CHOP的蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,當(dāng)采用siRNA處理后,FFA能夠顯著地增加Grp78的蛋白和mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。然而在相同條件下,FFA卻不能夠增加CHOP的蛋白和mRNA表達(dá)水平(P>0.05)。這些結(jié)果表明calpain-2參與了F

14、FA誘導(dǎo)的ERS中CHOP的表達(dá),而與Grp78的表達(dá)無關(guān)。
　　第四部分:Calpain-2參與游離脂肪酸誘導(dǎo)β-TC3細(xì)胞凋亡的研究
　　前三部分實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明, FFA作用可以增加β-TC3細(xì)胞凋亡水平。為了進(jìn)一步證實(shí)calpain-2分子參與了FFA誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的過程,我們使用calpain-2的siRNA處理細(xì)胞,并運(yùn)用Annexin V/PI雙標(biāo)染色法證實(shí),在下調(diào)β-TC3細(xì)胞calpain-2的表達(dá)水平后,相對(duì)

15、于BSA處理過的細(xì)胞而言,FFA處理并不能夠增加凋亡細(xì)胞的百分比(P>0.05)。
　　為了確認(rèn)這些結(jié)果,我們還檢測(cè)了calpase-12和caspase-3的活性水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過calpain-2的siRNA下調(diào)β-TC3細(xì)胞calpain-2的表達(dá)水平后,相對(duì)于BSA處理過的細(xì)胞而言,FFA處理并不能夠增加calpase-12和caspase-3的活性水平(P>0.05)。
　　由以上結(jié)果可以看出,下調(diào)calpa