PKCδ激活對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂肪變性的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)在近幾十年已經(jīng)成為常見的公共健康問題。NAFLD包含了從單純性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的臨床疾病狀態(tài),能發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。目前廣泛接受的理論是“二次打擊”學(xué)說,該學(xué)說認(rèn)為,以胰島素抵抗為首的“一次打擊”是引起肝細(xì)胞脂肪變性的主要原因,在此基礎(chǔ)上,以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic

2、reticulum stress,ERS)、線粒體功能障礙為標(biāo)志的“二次打擊”導(dǎo)致了單純性脂肪肝向NASH的演進(jìn)。
　　ERS在NASH肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用,是目前的研究熱點(diǎn),但機(jī)制不明。結(jié)合免疫球蛋白Bip,又稱GRP78或HspA5,是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶,被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白之一。剪切型X盒結(jié)合蛋白XBP-1s(spliced X-box binding protein1)不僅可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)元件(e

3、ndoplasmic reticulum stress response element,ERSE)結(jié)合誘導(dǎo)Bip、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)基因的轉(zhuǎn)錄活性,而且能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強(qiáng)因子-α甘露糖苷酶樣蛋白(ER degradation-enhancing-mannosidase-like protein,EDEM)基因的轉(zhuǎn)錄,因此XBP-1s表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的另一標(biāo)志。

4、
　　蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞漿內(nèi)的絲/蘇氨酸蛋白激酶,具有脂質(zhì)依賴性,至少包括12種亞型。PKCδ是新型PKC( novel PKC, nPKC)家族成員,主要在肝臟組織中發(fā)揮作用。與cPKC和aPKC不同,PKCδ能被游離脂肪酸的代謝產(chǎn)物二酰甘油(diacylglycerol,DAG)激活,并通過激活應(yīng)激活化蛋白激酶(c—jun N—terminal kinase,JNK)和

5、CHOP,促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),PKCδ激活與糖尿病及其相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。將編碼PKCδ的Prkcd基因經(jīng)整體或者肝特異性敲除后,小鼠肝臟胰島素敏感性得到明顯改善。與高脂飲食飼養(yǎng)野生型同窩對(duì)照小鼠相比較,Prkcd-/-小鼠肝臟和血漿甘油三酯水平及附睪脂肪組織都減少。這些線索提示:在NASH發(fā)生發(fā)展過程中,PKCδ參與肝細(xì)胞脂肪變性過程,其激活很可能是誘導(dǎo)ERS持續(xù)發(fā)生導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變進(jìn)展至NASH發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但目

6、前尚無PKCδ與ERS之間關(guān)系的研究。因此,本研究目的在于初步探討PKCδ與肝細(xì)胞脂肪變性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系,為防治非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFL)向NASH的演進(jìn)提供新思路。
　　方法:
　　1.構(gòu)建肝細(xì)胞株L02脂肪變性體外模型
　　1.1.人正常肝細(xì)胞株L02培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,造模前細(xì)胞進(jìn)行胎牛血清剝奪過夜。對(duì)照組培養(yǎng)于含1% FAF-BSA的D

7、MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),脂肪酸組給予0.5mM長(zhǎng)鏈游離脂肪酸(long-chain fatty acids,LCFA),油酸/棕櫚酸酯,2:1。根據(jù)誘導(dǎo)脂肪變的時(shí)間,脂肪酸組分為2h組、4h組、8h組和16h組。
　　1.2.油紅O染色檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)脂滴含量。
　　1.3.檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量。
　　2.Real-time PCR檢測(cè)PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平的表達(dá)變化。
　　3.Wes

8、tern-blot檢測(cè)PKCδ、Bip、XBP-1s在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　4.檢測(cè)PKCδ對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白Bip、XBP-1s的影響。
　　4.1.利用siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)降低PKCδ基因的表達(dá)。
　　4.2.檢測(cè)干擾PKCδ表達(dá)后Bip、XBP-1s的mRNA水平的表達(dá)變化。
　　4.3.檢測(cè)干擾PKCδ表達(dá)后Bip、XBP-1s的蛋白水平的表達(dá)變化。
　　5.檢測(cè)干擾PKCδ表達(dá)后對(duì)L02肝

9、細(xì)胞脂肪變性程度的影響。
　　6.利用SPSS18.0軟件,對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.油酸/棕櫚酸(2:1)體外誘導(dǎo)成功建立L02細(xì)胞脂肪變性模型
　　油紅O染色檢測(cè)脂肪酸組細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴明顯增多,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)脂滴越為明顯。ImageJ2X圖像分析提示L02細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞平均脂變面積顯示,脂肪酸組較對(duì)照組脂滴含量明顯增多(P<0.01)。經(jīng)油酸、棕櫚酸誘導(dǎo)處理后的L02細(xì)胞內(nèi)TG

10、含量也隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　2.Real-time PCR檢測(cè)PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平的表達(dá)變化。
　　與對(duì)照組相比,脂肪酸組的L02細(xì)胞 PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平顯著增加,且具有時(shí)間依賴效應(yīng)(P<0.05)。
　　3.Western-blot檢測(cè)PKCδ、Bip、XBP-1s在蛋白水平的表達(dá)變化。
　　脂肪酸組PKCδ、Bip、XB

11、P-1s蛋白水平的表達(dá)均較對(duì)照組增高。利用PKCδ充分激活所必須的磷酸化位點(diǎn) Thr-505檢測(cè) PKCδ激活狀態(tài),與對(duì)照組相比,混合脂肪酸刺激L02肝細(xì)胞早期階段,PKCδ磷酸化表達(dá)明顯升高,以4h組最為顯著,后期出現(xiàn)下降趨勢(shì)。
　　4.干擾PKCδ表達(dá)后對(duì)L02細(xì)胞Bip、XBP-1s的影響
　　Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中 Bip、XBP-1s的表達(dá)變化,在PKCδsiRNA轉(zhuǎn)染

12、組細(xì)胞中,加入脂肪酸培養(yǎng)8h后Bip、XBP-1s表達(dá)雖然仍有升高,但程度明顯低于對(duì)照轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。
　　干擾PKCδ表達(dá)后對(duì)L02肝細(xì)胞脂肪變性程度的影響
　　油紅O染色檢測(cè)脂肪變性陽性細(xì)胞率,脂肪酸誘導(dǎo)PKCδsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞染色陽性率明顯低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.01), PKCδsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞TG含量也顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.肝細(xì)胞脂肪變性過程中,PKCδ及