腺苷通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導食管癌EC109細胞凋亡.pdf

1、研究目的:
　　探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在腺苷(adenosine)誘導EC109細胞凋亡中的作用及其分子機制。
　　方法:
　　EC109細胞培養(yǎng)后按以下方法進行實驗,(1)四氮唑藍檢測法(MTT):腺苷2mmol·L-1作用于EC109細胞不同時間(24～72h)及將EC109細胞暴露于不同濃度腺苷(0.5～4mmol·L-1)作用36h,四氮唑藍檢測法觀察腺苷對EC109細胞生存率的時效和量效關(guān)系。(2)原位末端轉(zhuǎn)移酶標記

2、技術(shù)(TUNEL):不同濃度腺苷(0.5～4mmol·L-1)處理EC109細胞36h,原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)檢測細胞凋亡情況(3)免疫熒光染色法:細胞貼壁后加入正常培養(yǎng)基(空白組和對照組)或含腺苷2.0mmol·L-1培養(yǎng)基(腺苷處理組)處理細胞36h,免疫熒光觀察腺苷2.0mmol·L-1作用前后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白(GRP78、Caspase-4、Caspase-3、CHOP)的表達及亞細胞定位。(4)免疫印跡法(Westernbl

3、otting):細胞傳代至培養(yǎng)瓶,24h后分別加入含不同濃度腺苷(0.5～4mmol·L-1)的培養(yǎng)基處理36h,提取細胞總蛋白質(zhì),免疫印跡法檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白(GRP78、Caspase-4、CHOP)及NF-κB和凋亡執(zhí)行者Caspase-3分子的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、腺苷2mmol·L-1與EC109細胞作用24,36,48和72h,細胞存活率分別為(57.7±15.0)％,(56.5±11.1)%,

4、(43.8±5.7)%和(28.8±4.1)%,呈時間依賴性下降(r=0.9192,P<0.01)。不同濃度腺苷(0.5,1,2和4mmol·L-1)處理EC109細胞36h,隨藥物濃度增加,細胞存活率依次為(83.14±11.2)%,(67.86±6.72)%,(55.31±5.01)%和(45.39±5.45)%,呈劑量依賴性降低(r=0.8252,P<0.01)。
　　2、腺苷0.5～4mmol·L-1處理EC109細胞36

5、h,細胞凋亡率分別為(15.5±1.1)%,(28.2±0.8)%,(40.1±2.2)%和(50.6±1.3)%,與對照組(2.1±0.3)%相比均明顯增加(r=0.874,P<0.05)。
　　3、腺苷2mmol·L-1與EC109細胞作用36h,免疫熒光法檢測結(jié)果表明,對照組EC109細胞胞漿中出現(xiàn)GRP78的表達,腺苷處理組表達增多;Caspase-4,Caspase-3和CHOP在對照組EC109細胞胞漿中無表達,提示E

6、C109細胞經(jīng)腺苷處理后Caspase-4,Caspase-3和CHOP蛋白出現(xiàn)表達并發(fā)生核移位。
　　4、Westernblotting結(jié)果表明GRP78,Caspase-4,Caspase-3,CHOP和NF-κB表達量呈劑量依賴性增加(rGRP78=0.9471,rCaspase-4=0.8977,rCaspase-3=0.968,rCHOP=0.9762,rNF-κB=0.9471,P<0.05)。
　　結(jié)論: