AcMNPV凋亡抑制因子Ac-IAP1-2的功能研究.pdf

1、IAPs，統(tǒng)稱為凋亡抑制因子(Inhibitors of apoptosis)，最初在桿狀病毒中作為一類抗凋亡蛋白被發(fā)現(xiàn)，之后在其他物種（如哺乳動物，果蠅，線蟲等）中也發(fā)現(xiàn)了它們的身影。在桿狀病毒中，IAPs是調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡進程的一大類蛋白，目前根據(jù)其氨基酸序列的同源性將其分為六類（IAP1-6）。各類IAPs的結(jié)構(gòu)相似，功能卻不盡相同，有些IAP有促凋亡活性。宿主通過啟動其凋亡程序來抗病毒感染，而病毒又通過抑制細(xì)胞凋亡，來促進其自身

2、的增殖傳播。為明確IAPs在苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)抗蟲過程中的作用機制，開展了Ac-IAPs的功能研究，并在此基礎(chǔ)上，探討了Ac-IAP1/2對重組病毒AcMNPV-BmK IT(P10)細(xì)胞毒性的協(xié)同效應(yīng)。
　　本研究分為三部分:
　　第一部分:凋亡抑制因子Ac-IAP1/2的功能分析。<

3、br>　　我們首先利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒重組表達系統(tǒng)構(gòu)建了過表達Ac-IAP1/2的重組病毒AcMNPV-iap1/2-egfp。然后分別用1 MOI的重組病毒AcMNPV--iap1/2-egfp感染Sf9細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察與Western blot分析結(jié)果表明，Ac-IAP1/2-EGFP的表達量隨著感染時間的延長而逐漸增加，并在120 h達到最大。接著，分別用0.001 MOI的野生病毒AcMNPV和重組病毒AcM

4、NPV-iap1/2-egfp感染Sf9細(xì)胞1-4天，蝕斑實驗檢測不同處理組細(xì)胞和培養(yǎng)液中子代病毒粒子的數(shù)量，結(jié)果表明AcMNPV-iap2-egfp促進子代病毒增殖;而AcMNPV-iap1-egfp抑制子代病毒增殖，表明Ac-IAP2可促進子代病毒增殖，而Ac-IAP1則執(zhí)行相反的功能。之后，分別用1.5-12 MOI的AcMNPV和AcMNPV-iap1/2-egfp感染Sf9細(xì)胞48h，MTT試劑檢測Sf9細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表

5、明AcMNPV-iap2-egfp以劑量-依賴的形式促進細(xì)胞增殖;AcMNPV-iap1-egfp無論在正常條件還是營養(yǎng)脅迫條件下，均顯著抑制細(xì)胞增殖。這表明Ac-IAP1具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，Ac-IAP2則可促進細(xì)胞增殖。在抗蟲實驗中，分別用20μL，1×107 pfu/mL的AcMNPV-egfp和AcMNPV-iap1/2-egfp連續(xù)飼喂三齡期棉鈴蟲幼蟲五天，檢測棉鈴幼蟲的生長情況、死亡率及蛹化率。結(jié)果表明，由AcMNPV-

6、iap2-egfp飼喂的棉鈴蟲，不僅生長緩慢，死亡率也遠高于其他兩個病毒處理組。而AcMNPV-iap1-gfp飼喂的棉鈴蟲，死亡率和化蛹率與野生熒光標(biāo)簽病毒AcMNPV-egfp處理組相差無幾，表明Ac-IAP1盡管表現(xiàn)出較強的細(xì)胞毒性，但過表達Ac-IAP1的病毒AcMNPV-iap1-egfp的殺蟲效果不佳，而AcMNPV-iap2-egfp則具有較高抗蟲活性。
　　第二部分:BIR2結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏c-IAP2的抗凋亡功能至關(guān)

7、重要。
　　采用GenBank和PDB數(shù)據(jù)庫檢索Ac-IAP1/2的功能域，DNAMAN軟件比對分析并確定Ac-IAP1/2間序列差異較大的功能域為BIR2結(jié)構(gòu)域。我們通過重疊PCR技術(shù)將Ac-IAP2的BIR2結(jié)構(gòu)域置換為Ac-IAP1的BIR2結(jié)構(gòu)域，并用Bac-to-Bac昆蟲表達系統(tǒng)構(gòu)建了過表達Ac-IAP2突變體Ac-IAP2-BIR1（iap1）的重組病毒AcMNPV--iap2-BIR2(iap1)-egfp。然后，

8、用1 MOI的AcMNPV-iap2-BIR2(iap1)-egfp感染Sf9細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察與Western blot結(jié)果表明，隨著感染時間的延長，被感染的細(xì)胞（即帶綠色熒光的細(xì)胞）顯著增多、細(xì)胞的熒光強度顯著增強，Ac-IAP2-BIR2(iap1)-EGFP的表達量增加，并在120 h達到最大。接著，分別用3-12 MOI的AcMNPV-iap1/2-egfp和AcMNPV-iap2-BIR2(iap1)-egfp感染Sf9細(xì)

9、胞48 h，MTT試劑檢測Sf9細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明，與AcMNPV-iap2-egfp僅差一個BIR2功能域的AcMNPV-iap2-BIR2(iap1)-egfp卻具有比AcMNPV-iap1-egfp更高的細(xì)胞增殖抑制率。這表明Ac-IAP2-BIR2（iap1）促進細(xì)胞凋亡，BIR2結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏c-IAP2的抗凋亡功能至關(guān)重要。
　　第三部分:Ac-IAP1/2對重組病毒AcMNPV-BmK IT(P10)促凋亡活性的

10、協(xié)同效應(yīng)分析。
　　前兩部分實驗已經(jīng)對Ac-IAP1/2的功能作了分析，那么作為調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的兩個重要因子，它們是否可提高我們已有的重組蝎昆蟲特異性毒素(BmK IT)的AcMNPV-BmK IT的細(xì)胞毒性？鑒于我們前期的研究，早期啟動子(IE1)調(diào)控表達的BmK IT在病毒感染早期可促進子代病毒增殖，而早期(IE1)和晚期啟動子(P10)調(diào)控表達的BmK IT均可促進細(xì)胞凋亡。本節(jié)中，我們首先分析了晚期啟動子(P10)調(diào)控表

11、達的BmK IT對子代病毒增殖的影響。分別用1 MOI的AcMNPV和AcMNPV--BmK IT(P10)侵染Sf9細(xì)胞，結(jié)果顯示在16-48 h內(nèi)，AcMNPV-BmK IT(P10)處理組細(xì)胞中的病毒粒子積累量均低于野生病毒處理組，表明AcMNPV-BmK IT(P10)可抑制子代病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的累積。接著，用1 MOI的AcMNPV-BmK IT(P10)侵染Sf9細(xì)胞，Real-time PCR結(jié)果表明， BmK IT的轉(zhuǎn)錄

12、水平在病毒感染24 h后，呈減弱趨勢。而在病毒感染48h時宿主細(xì)胞內(nèi)的子代病毒粒子積累量有一個輕微的增長，這表明BmK IT是抑制宿主細(xì)胞內(nèi)子代病毒粒子積累的原因;之后，用1 MOI的AcMNPV和AcMNPV-BmK IT(P10)侵染Sf9細(xì)胞，Real-time PCR結(jié)果表明在病毒感染早期AcMNPV-BmK IT(P10)處理組中vp39基因的轉(zhuǎn)錄水平高于野生病毒處理組，而感染晚期與之相反。上述結(jié)果共同表明P10啟動子調(diào)控表達

13、的BmK IT，在病毒感染早期，促進子代病毒增殖和出芽，而在感染晚期促進細(xì)胞凋亡、抑制子代病毒的增殖，利于子代病毒傳播。接著，分別用10 MOI的AcMNPV和AcMNPV-BmKIT(P10)侵染Sf9細(xì)胞，DAPI熒光染色結(jié)果顯示，兩病毒處理組的細(xì)胞核形態(tài)和大小沒有明顯差異，表明重組病毒AcMNPV-BmK IT(P10)對子代病毒增殖和出芽的影響，并不依賴存在于細(xì)胞核中病毒發(fā)生基質(zhì)的形成。在明確了AcMNPV-BmK IT(P10

14、)在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖的規(guī)律后，我們檢測了Ac-IAP1/2對重組病毒AcMNPV-BmK IT(P10)促細(xì)胞凋亡活性的協(xié)同效應(yīng)，分別用AcMNPV-iap1/2-egfp(3MOI)與AcMNPV-BmK IT(P10)(1.5、3和6 MOI)共侵染Sf9細(xì)胞，結(jié)果表明，Ac-IAP1可協(xié)同AcMNPV-BmK IT(P10)促進宿主細(xì)胞凋亡，且其細(xì)胞毒性高于BmK IT;Ac-IAP2通過抑制細(xì)胞凋亡為BmK IT促進子代病毒增殖爭

15、取了時間，使得子代病毒大量增殖，從而提高了AcMNPV-BmK IT(P10)的細(xì)胞毒性。
　　本研究分別在蟲體和細(xì)胞水平上分析了AcMNPV侵染宿主過程中調(diào)控宿主凋亡的關(guān)鍵因子Ac-IAP1/2的功能，明確了BIR2結(jié)構(gòu)域?qū)c-IAP2抗凋亡功能的重要性，獲得了一株抗蟲效率較高的病毒殺蟲劑AcMNPV-iap2-egfp，并進一步完善了AcMNPV-BmK IT(P10)細(xì)胞毒性機制及IAPs對其協(xié)同效應(yīng)的研究。本研究為桿狀病