蛋白酶體抑制劑MG132可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)人肝癌7721細(xì)胞凋亡.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文蛋白酶體抑制劑MG132可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)人肝癌7721細(xì)胞凋亡姓名：方芳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：申宗侯20070501蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞7 7 2 1凋亡中文摘要目的蛋白酶體抑制劑是近幾年來(lái)抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。本課題旨在研究蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 對(duì)人

2、肝癌7 7 2 1 細(xì)胞的增殖抑制的影響及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的聯(lián)系。方法為觀察M G l 3 2 對(duì)7 7 2 1 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，以不同濃度的M G l 3 2 ( 2 u M ，5 u M ，1 0 u M ) 處理細(xì)胞2 4 小時(shí)后，用M T T 法檢測(cè)7 7 2 1細(xì)胞的增殖情況；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M G l 3 2 對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況；為了驗(yàn)證M G l 3 2 對(duì)7 7 2 l 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，采用了H o

3、 e c h s t 染色法在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡；為探討蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 影響7 7 2 1 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，特別是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系，首先擇取了5 u M 濃度的M G l 3 2 處理細(xì)胞2 4小時(shí)，然后運(yùn)用以下方法檢測(cè)可能參與其凋亡誘導(dǎo)作用的各分子變化；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( R T - P C R ) 和蛋白質(zhì)印跡( W e s t e r n b l o t ) 檢測(cè)7 7 2 1 細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)

4、網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性分子B i p ／G R P 7 8 和X B P - 1 的表達(dá)變化；用W e s t e r n b l o t 檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志性分子及凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子C H O P 的表達(dá)變化；為了探討細(xì)胞通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑參與凋亡的機(jī)制，還用W e s t e r nb l o t 方法檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性誘導(dǎo)的e a s p a s e - 1 2 ，以及其下游的e a s p a s e - 9 和c a s p a s e

5、 ．3 的剪切表達(dá)情況。 結(jié)果M T T 法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 對(duì)人肝癌7 7 2 1 細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有明顯的抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)M G l 3 2 處理后的7 7 2 1 細(xì)胞出現(xiàn)了明顯凋亡，且這種增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用均表現(xiàn)出濃度依賴性，H o e c h s t染色也發(fā)現(xiàn)了凋亡小體。以濃度為5 u M 的M G l 3 2 處理7 7 2 1 細(xì)胞2 4 小時(shí)后R T - P C R

6、結(jié)果顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子B i p ／G R P 7 8 的m R N A 表達(dá)顯著增高，W e s t e r n b l o t 結(jié)果也可見(jiàn)其蛋白表達(dá)的增高；R T - P C R 結(jié)果顯示與陽(yáng)性對(duì)照相比，加藥處理后的7 7 2 1 細(xì)胞中X B P l m R N A 未見(jiàn)剪接，W e s t e r n b l o t 結(jié)果也表明了未剪接的X B P l 蛋白表達(dá)增加；W e s t e r nb l o t 檢測(cè)C H O

7、P 表達(dá)發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)顯著增高。W e s t e r nb l o t 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中標(biāo)志性分子c a s p a s e 一1 2 發(fā)生了剪切激活，其下游的c a s p a s e - 9 和c a s p a s e ．3 也發(fā)生了剪切激活。結(jié)論蛋白酶體抑制劑M G l 3 2 可誘導(dǎo)人肝癌7 7 2 1 細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)增殖抑制和凋亡，由于泛素一蛋白酶體通路受阻導(dǎo)致大量未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中引起