IRF-2基因在干擾素-γ影響胰腺腺泡細胞炎癥反應與自噬活性中的作用研究.pdf

1、目的：
　?。?）觀察IFN-γ對AR42J細胞急性胰腺炎過程中細胞上清IL-1、IL-6、TNF-α及AMS等炎癥因子的影響，以及凋亡與自噬作用的改變；并探討自噬改變對AR42J細胞炎癥反應的影響及IRF-2基因的改變，初步探討自噬機制在急性胰腺炎中的作用和意義。
　?。?）通過構建IRF-2基因下調的細胞模型為研究對象，以轉染陰性載體的AR42J細胞作為陰性載體對照組（IRF2-NC），探討IRF-2蛋白表達改變對AR4

2、2J細胞自噬作用與炎癥反應的影響，從自噬調控角度探討IRF-2基因在急性胰腺炎發(fā)生機制中的作用。
　　方法：
　?。?）采用不同濃度梯度的IFN-γ預處理AR42J細胞，雨蛙素刺激制備急性胰腺炎細胞模型，采用ELISA方法檢測檢測各組細胞上清IL-1、IL-6、TNF-α及AMS的濃度，Western blot方法檢測活化的cleaved Caspase3與Caspase9蛋白的表達。
　　（2）采用不同濃度梯度的IF

3、N-γ預處理AR42J細胞，雨蛙素刺激制備急性胰腺炎細胞模型，采用透射電鏡的方法觀察細胞內自噬體形成情況。采用Western blot方法檢測自噬調控基因LC3II/I、Beclin1、LAMP2、Cathepsin B表達的改變。
　　（3）采用自噬抑制劑3-MA預處理AR42J細胞，然后加入雨蛙素至細胞中制備急性胰腺炎細胞模型，采用Western blot方法檢測自噬調控基因LC3II/I、Beclin1表達的改變。采用ELI

4、SA方法檢測檢測各組細胞上清中IL-1、IL-6、TNF-α及AMS的濃度，并采用Western blot方法檢測IRF-2表達的改變。
　　（4）采用慢病毒轉染的方式構建IRF-2基因表達下調的AR42J細胞株，應用RT-PCR與Western blot方法對基因表達進行鑒定，以轉染陰性載體的AR42J細胞作為陰性載體對照組（IRF2- NC），采用雨蛙素造模的方法至以上構建的各組細胞中制備急性胰腺炎細胞模型，采用Western

5、 blot方法檢測自噬調控基因LC3II/I、Beclin1及IRF-2蛋白表達的改變。采用ELISA方法檢測檢測各組細胞上清中IL-1、IL-6、TNF-α及AMS的濃度。
　　結果：
　?。?）ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)，未采用IFN-γ預處理的細胞炎癥因子大量釋放，而當IFN-γ濃度依次升高時，各組細胞上清IL-1、IL-6、TNF-α及AMS的濃度逐漸下降，濃度值均明顯低于對照組細胞（P<0.05）。采用Western

6、blot方法檢測活化的cleaved Caspase3與Caspase9蛋白的表達結果，活化的cleaved caspase3與Caspase9蛋白在以上各組均無表達，無明顯差異。
　?。?）采用透射電鏡的方法觀察發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎初期，采用IFN-γ預處理細胞中自噬小體數(shù)量明顯增加，自噬小體數(shù)量明顯高于對照組。當IFN-γ濃度依次升高時，LC3II/I、Beclin1、LAMP2、Cathepsin B表達逐漸升高，均明顯高于對照

7、組細胞。
　　（3）3-MA對細胞內自噬具有抑制作用；當自噬機制受抑制時，IL-1、IL-6、TNF-α及AMS細胞炎性因子釋放增加。當IFN-γ濃度依次升高時，IRF-2表達逐漸升高。
　?。?）采用慢病毒轉染的方式構建IRF-2基因表達下調的AR42J細胞株并應用RT-PCR與Western blot方法鑒定。當IRF-2蛋白表達下調后，LC3II/I、Beclin1蛋白表達在急性胰腺炎組明顯降低；當自噬機制受抑制時，各

8、組細胞炎癥反應增強，上清中IL-1、IL-6、TNF-α及AMS等炎性因子釋放增加。
　　結論：
　?。?）IFN-γ可能對AR42J細胞具有抑制炎性反應的作用，該作用可能通過增強細胞內自噬活性實現(xiàn)。自噬機制對AR42J細胞炎性反應具有保護作用，干擾素調節(jié)因子IRF-2可能參與細胞自噬機制的調控及炎癥反應的變化過程。
　?。?）當IRF-2蛋白表達下調后，LC3II/I、Beclin1自噬相關蛋白表達明顯降低；當自噬機