沉默Beclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)急性胰腺炎細(xì)胞模型的炎癥反應(yīng)及自噬的影響.pdf

1、目的:
　　自噬是生物體進(jìn)化過程中存在的高度保守的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)降解過程，細(xì)胞通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體吞噬胞內(nèi)物質(zhì)后轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中進(jìn)行降解再利用。自噬在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中作用的研究是當(dāng)前急性胰腺炎基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的主要熱點(diǎn)之一。自噬相關(guān)基因Beclin1是自噬起始階段的重要調(diào)控分子，本研究首先采用RNA干擾技術(shù)沉默大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J的Beclin1基因表達(dá)，構(gòu)建穩(wěn)定的Beclin1基因沉默的AR42J細(xì)胞系。通過原始細(xì)胞系與轉(zhuǎn)

2、染后細(xì)胞株的對(duì)比，我們了解Beclin1基因在AR42J細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬及糜蛋白酶表達(dá)中的作用，并進(jìn)一步探討B(tài)eclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的的急性胰腺炎細(xì)胞模型中炎性因子水平、凋亡、自噬及超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法:
　　1.設(shè)計(jì)并合成3種靶向大鼠Beclin1 mRNA的shRNA及陰性對(duì)照shRNA，分別插入質(zhì)粒GV112，重組質(zhì)粒分別命名為p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、p-sh-Be

3、clin1-3及p-shRNA-NC。應(yīng)用lipo3000將重組質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)入AR42J細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Beclin1 mRNA表達(dá)，篩選出沉默效率最高的質(zhì)粒，在293T細(xì)胞內(nèi)包裝成慢病毒(LV-shBeclin1)，感染AR42J細(xì)胞，應(yīng)用嘌呤霉素篩選，采用RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)病毒感染細(xì)胞Beclin1 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　2.采用CCK8試劑盒測(cè)定原始細(xì)胞系與轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株的生長曲線，了解Becli

4、n1基因?qū)R42J細(xì)胞增殖的作用。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)原始細(xì)胞系與轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株的凋亡情況，了解Beclin1基因?qū)R42J細(xì)胞凋亡的影響。采用透射電鏡觀察兩組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，了解Beclin1基因?qū)R42J細(xì)胞中自噬影響。采用免疫熒光技術(shù)觀察兩組細(xì)胞糜蛋白酶的表達(dá)情況，了解Beclin1基因?qū)R42J細(xì)胞中糜蛋白酶表達(dá)的影響。
　　3.采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雨蛙素誘導(dǎo)的的急性胰腺炎細(xì)胞模型不同時(shí)間點(diǎn)(0h、1h、4h、6

5、h、8h、12h、24h、36h及48h)上清液中的炎性因子水平，及沉默Beclin1基因后炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平的改變，從而探討沉默Beclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的的急性胰腺炎細(xì)胞模型中炎性因子水平的影響。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞模型中不同時(shí)間點(diǎn)(0h、1h、4h、6h、8h、12h、24h及36h)的凋亡相關(guān)蛋白BCL2及自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)水平，及沉默Beclin1基因后BCL2及

6、LC3蛋白水平的改變，從而探討沉默Beclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的的急性胰腺炎細(xì)胞模型中凋亡及自噬的影響。采用透射電鏡技術(shù)觀察以1×10-8mol/L濃度的雨蛙素作用4h后的兩組細(xì)胞中自噬水平及炎癥程度，從而探討沉默Beclin1基因?qū)τ晖芩卣T導(dǎo)的的急性胰腺炎細(xì)胞模型超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.重組質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離及測(cè)序證實(shí)shRNA序列符合預(yù)期。p-sh-Beclin1-1、p-sh-Beclin1-2、

7、p-sh-Beclin1-3及p-shRNA-NC轉(zhuǎn)染后AR42J細(xì)胞Beclin1 mRNA表達(dá)抑制率分別為（17.8±4.0）％、（30.6±2.8）％、（45.8±7.7）％、（7.0±11.8）％。3個(gè)p-sh-Beclin1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)抑制率均較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），而轉(zhuǎn)染p-shRNA-NC細(xì)胞的表達(dá)抑制率與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑制率最高的p-sh-Beclin1-3經(jīng)慢病毒包裝，感染

8、AR42J細(xì)胞，應(yīng)用嘌呤霉素篩選，LV-shBeclin1感染細(xì)胞的Beclin1 mRNA表達(dá)抑制率為（86.1±1.2）％，蛋白表達(dá)抑制率為（87.9±2.8）％，均與未感染細(xì)胞無表達(dá)抑制的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。
　　2.沉默Beclin1基因?qū)R42J細(xì)胞增殖的影響并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。沉默Beclin1基因使得AR42J細(xì)胞中自噬泡數(shù)目減少，但并不影響細(xì)胞糜蛋白酶的表達(dá)。<

9、br>　　3.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)提示急性胰腺炎初期炎性因子水平逐步上升，6～8h時(shí)達(dá)最高峰后炎性因子水平逐漸下降后再次升高，36～48h時(shí)達(dá)到第二次高峰。沉默Beclin1基因后，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的IL-1β水平下降、IL-6水平多數(shù)無明顯改變、TNF-α水平多數(shù)呈上升趨勢(shì)。蛋白質(zhì)印跡法提示沉默Beclin1基因使得雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎中不同時(shí)間點(diǎn)的BCL2多數(shù)下降，而LC3蛋白多數(shù)升高。以1×10-8mol/L濃度的雨蛙素作用4h后，AR4

10、2J細(xì)胞中出現(xiàn)急性胰腺炎現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中自噬泡明顯減少，且并未觀察到炎癥改變。
　　結(jié)論:
　　成功建立Beclin1基因沉默的AR42J細(xì)胞株。Beclin1基因參與自噬體的形成，且可以抑制AR42J細(xì)胞的凋亡，它對(duì)細(xì)胞增殖和糜蛋白酶表達(dá)并無明顯影響。雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎細(xì)胞模型中炎性因子水平隨時(shí)間變化，呈先升后降再升的模式改變。沉默Beclin1基因影響急性胰腺炎中炎性因子水平，及凋亡自噬的程度，且它對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)