利用iPS細胞技術開展小鼠肝癌細胞重編程研究.pdf

1、胚胎干細胞（ES細胞）具有自我更新及多向分化潛能，為發(fā)育學、遺傳學、人類疾病的發(fā)病機理與替代治療等研究提供非常寶貴的資源。自日本和美國研究小組先后用四種基因將小鼠(2006年8月)和人(2007年11-12月)的體細胞在體外重編程為誘導性多潛能干細胞(Inducedpluripotentstemcells，iPScells)，在短短5年多時間內(nèi)，iPS細胞的研究和關注度呈爆炸式增長，并且取得了一些突破性的進展。由于iPS細胞技術較經(jīng)典的

2、體內(nèi)外重編程方法存在巨大優(yōu)勢，科學家們紛紛開始利用此項技術進行體細胞及腫瘤細胞重編程研究。
　　 iPS細胞技術是借助基因導入技術將某些特定因子基因導入動物或人的體細胞，以將其重編程或誘導為ES細胞樣的細胞，即iPS細胞。目前，常用的iPS細胞技術包括通過逆轉錄病毒、慢病毒和腺病毒等介導的方式，這些方法均可將轉錄因子對應的基因導入體細胞，進而將其重編程為iPS細胞?，F(xiàn)階段常見的iPS細胞制備流程包括(1)分離和培養(yǎng)宿主細胞;(2

3、)通過逆轉錄病毒、慢病毒或腺病毒等介導的方式將外源基因導入宿主細胞;(3)病毒感染后的細胞消化傳代于飼養(yǎng)層細胞上，并以ES細胞專用培養(yǎng)體系來培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)基中根據(jù)需要加入相應的小分子物質以促進重編程;(4)數(shù)天后，出現(xiàn)ES細胞樣的克隆。通過上述方法得到的iPS細胞一般在克隆形態(tài)、生長特性、表面標志物、基因表達模式、表觀遺傳學特征、擬胚體形成、畸胎瘤形成和嵌合體形成（針對動物）等方面與ES細胞的非常相似，因而從以上幾個方面對重編程后的細

4、胞進行鑒定。
　　 為了更好地將iPS細胞技術與臨床應用相結合，科學家們經(jīng)過大量研究，獲得了一系列令人欣慰的成果，包括成功將小鼠、大鼠、恒河猴和人等的體細胞在體外重編程為iPS細胞，并成功建立了個體特異的或疾病特異的人iPS細胞系;開啟了借助轉座子介導的轉基因方法高效率將轉座子表達載體導入體細胞，并將其重編程為virus-freeiPS細胞;已有科學家從所獲得的動物和人的iPS細胞中移除先前導入的重編程因子基因，從而獲得近似治療

5、型的iPS細胞(Virus-free和先前導入的重編程因子基因已被刪除)等等。上述這些成就又進一步加大了科學家們研究iPS細胞技術的熱情，關于iPS細胞的研究經(jīng)久不衰，并一次次在生命科學領域引起轟動。
　　 而繼成功將鼠和人的體細胞重編程為iPS細胞后，科學家們開始思考將腫瘤細胞重編程為iPS細胞的可能性，這一猜想也很快得到了證實。2008年，Shi-LungLin等將miR302s導入黑色素瘤細胞和前列腺癌細胞，成功將腫瘤細胞

6、重編程為iPS細胞。2009年7月Hochedlinger課題組用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四基因將小鼠黑色素瘤細胞重編程為iPS細胞，2010年，JanE等成功利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四因子將慢性粒細胞白血病細胞重編程為iPS細胞。
　　 上述研究成果證實了從理論上來說，任何一種（小鼠或人的）體細胞以及腫瘤細胞均可被特定的因子重編程為iPS細胞。也就是說，被逆轉的細胞不局限于特定的細胞類型及特

7、定的分化階段，其可以是內(nèi)中外三胚層任一胚層來源的細胞，既可以來源于胚胎細胞，也可以來源于新生兒、成人甚至是終末分化的成熟細胞。而關于腫瘤細胞重編程為iPS細胞的研究，也為在體外研究腫瘤細胞重編程提供了重要的技術手段和技術平臺，同時為臨床腫瘤治療開啟了新思路。
　　 研究表明，體細胞或者腫瘤細胞重編程為iPS細胞所需轉錄因子組合需根據(jù)細胞種類及其上相應轉錄因子表達水平或額外加入的小分子加以靈活選擇。一般情況下，Oct4、Sox2、

8、c-Myc和Klf4組合即可將體細胞重編程為iPS細胞。適當選用小分子化合物加入重編程，可大幅度提高重編程效率和/或減少轉錄因子使用個數(shù)，而當增加轉錄因子使用個數(shù)(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc和Klf4)，也可大幅度提高重編程效率。
　　 慢病毒基因投遞系統(tǒng)是目前較為常用的基因導入技術，借助慢病毒基因投遞系統(tǒng)可將慢病毒中攜帶的外源基因高效整合進宿主基因組中，并且此外源基因可在宿主體內(nèi)長期穩(wěn)定表達。過去用

9、科學家們采用分別攜帶Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2四種基因的慢病毒載體進行病毒生產(chǎn)，然后將病毒以一定的比例混合感染目的細胞誘導體細胞及腫瘤細胞重編程。而為了更高效地完成重編程，選擇同時攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種重要基因的載體，可以讓這四種基因更好地發(fā)揮協(xié)同作用，并且長期保持在一穩(wěn)定水平，更有利于細胞發(fā)生重編程。報告基因EGFP的存在，使重編程的過程更為可視化，通過觀察綠色熒光的表達情況，可以判斷慢病毒將外

10、源基因整合進宿主基因組的效率，并且在重編程過程中更加直觀地了解重編程的進程，有利于對實驗結果的分析。
　　 鑒于此，本試驗擬借助慢病毒載體法將同時攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種基因和報告基因綠色熒光蛋白(EGFP)的載體pLentG-KOSM導入小鼠肝癌細胞(Hep1-6)，以開展腫瘤細胞體外重編程研究，在此基礎上構筑小鼠腫瘤細胞體外重編程的技術平臺。
　　 方法:
　　 1慢病毒載體pLent

11、G-KOSM的鑒定
　　 酶切鑒定NotⅠ、XbaⅠ線性化pLentG-KOSM，線性化產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳。
　　 PCR鑒定根據(jù)Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2序列設計引物分別擴增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因;PCR擴增后，取5μl反應液進行3％瓊脂糖凝膠電泳。
　　 2慢病毒生產(chǎn)與滴度測定
　　 慢病毒包裝按標準程序進行慢病毒包裝（脂質體介導的瞬時轉染）。
　　

12、 慢病毒滴度測定用5μl病毒上清感染15萬293T細胞，48h后4％多聚甲醛固定，DAPI染色，熒光顯微鏡下計數(shù)EGFP陽性細胞和總細胞數(shù)，將其帶入公式:病毒滴度(IU/ml)=EGFP陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)÷5×1.5×105×103。
　　 3慢病毒載體法重編程Hep1-6細胞
　　 用病毒感染攜帶有EGFP和KOSM基因的Hep1-6細胞，12h后棄去病毒感染液，更換為含有10％胎牛的DMEM培養(yǎng)基。
　　

13、將感染后的Hep1-6細胞消化后計數(shù)，傳代于飼養(yǎng)層細胞(feeder)上，更換為新鮮小鼠ES細胞培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基直到第10天克隆足夠大時挑克隆擴大培養(yǎng)。
　　 4重編程后獲得細胞的生物學特性
　　 1)重編程后細胞克隆形態(tài)及EGFP表達情況;
　　 2)AP染色;
　　 3)RT-PCR檢測鼠ES細胞標志性基因表達;
　　 4)細胞免疫熒光檢測鼠ES細胞標志性抗原表達;
　　 5

14、)核型分析;
　　 6)懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體形成及體外分化情況;
　　 7)重編程后細胞接種至裸鼠皮下，觀察成瘤情況。
　　 結果:
　　 1慢病毒載體pLentG-KOSM鑒定
　　 酶切鑒定pLentG-KOSM經(jīng)NotⅠ和XbaⅠ線性化，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳均可見預期大小的條帶。
　　 PCR鑒定以質粒pLentG-KOSM為模板，分別擴增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox

15、2基因，PCR產(chǎn)物大小均與預期值相符。
　　 2慢病毒包裝
　　 攜帶pLentG-KOSM的慢病毒載體與病毒包裝質粒共轉染293T細胞，24h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，預示轉染成功。按照上述方法進行慢病毒滴度測定，病毒滴度值都在1×106IU/ml以上。
　　 3慢病毒載體法重編程Hep1-6細胞
　　 病毒感染Hep1-6細胞后48小時可見綠色熒光，預示感染Hep1-6細胞成功，鋪于飼養(yǎng)層細胞(

16、Feeder)后第4天可見到iPS細胞樣克隆出現(xiàn)，第10天克隆足夠大可以挑克隆以擴大培養(yǎng)，預示著Hep1-6細胞已開始重編程。
　　 4.重編程后的細胞生物學特性鑒定
　　 1)第2-3天可見Hep1-6細胞形態(tài)發(fā)生變化，4-6天可見iPS細胞樣克隆，10天左右見到典型iPS細胞樣克隆，挑取典型克隆繼續(xù)培養(yǎng);多次純化后得到三株典型iPS細胞樣克隆形態(tài)的細胞;
　　 2)3株細胞均具有典型的iPS細胞樣克隆形態(tài)，A

17、P染色呈陽性;
　　 3)3株細胞未如預期表達ES細胞特有的標志性基因Nanog，Esg1，Dax1，Zfp296等;
　　 4)3株細胞能表達mES細胞特有的標志性抗原:Oct4(+)，Sox2(+)，Nanog(+);
　　 5)3株細胞核型分析結果尚未回報;
　　 6)3株細胞均具有體外分化形成囊性擬胚體的能力;
　　 7)3株細胞迄今未能形成畸胎瘤，但是惡性程度較重編程前的Hep1-6細胞