HNF1α，HNF4α，F(xiàn)OXA3聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞重編程.pdf

1、目的:
　　肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第六位，病死率居第二位。盡管近年來(lái)肝癌的診療技術(shù)不斷發(fā)展，其早期診斷困難、放化療不敏感和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高的現(xiàn)狀沒(méi)有根本改觀。唯一被FDA批準(zhǔn)用于肝癌的靶向治療的藥物索拉非尼，治療效果非常不理想。因此，肝癌的治療研究亟需調(diào)整思路，尋找更加有效的治療手段。
　　腫瘤的誘導(dǎo)分化是近些年興起的一種治療方法，分化治療可誘導(dǎo)低分化的腫瘤細(xì)胞向成熟表型分化，抑制其增殖和轉(zhuǎn)移并

2、促進(jìn)其凋亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。迄今分化治療應(yīng)用最好的是利用全反式維甲酸治療急性早幼粒白血病，已有大量的病人獲得了很好的治療效果。血液腫瘤分化治療的成功也帶動(dòng)了實(shí)體腫瘤的分化治療研究，相繼出現(xiàn)了應(yīng)用全反式維甲酸、二甲基亞砜和砷劑治療乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌的研究，但肝癌的分化治療研究目前還很少。
　　肝細(xì)胞核因子(Hepatocyte nuclear factor,HNF)是一類在肝細(xì)胞中相對(duì)特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在肝細(xì)胞的分化

3、和功能維持方面發(fā)揮重要作用。HNF家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)以及D-結(jié)合蛋白(DBP)6大類因子。已有研究顯示單獨(dú)應(yīng)用HNF1α或HNF4α導(dǎo)入HNF1α或HNF4α低表達(dá)的肝癌細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化。但在相當(dāng)一部分肝癌中HNF1α或HNF4α的表達(dá)并不降低，對(duì)這部分肝癌而言，單獨(dú)應(yīng)用HNF1α或HNF4α療效有限。此外，將多種肝細(xì)胞核因子聯(lián)合導(dǎo)入肝癌細(xì)胞協(xié)同發(fā)揮作用，

4、理論上誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化的效果可能更好。前期有學(xué)者從肝細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子中篩選能誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的轉(zhuǎn)錄因子，最終篩選到了HNF1α、HNF4α和FOXA3(HNF3γ)。將這三種因子聯(lián)合轉(zhuǎn)入人成纖維細(xì)胞后，可將人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成肝細(xì)胞(hiHeps，humaninduced hepatocytes)。hiHeps形態(tài)類似正常肝細(xì)胞，且具有肝細(xì)胞的標(biāo)志物和生物學(xué)功能。
　　在前期研究的基礎(chǔ)上，本課題旨在聯(lián)合應(yīng)用HNF1α

5、、HNF4α和FOXA3抑制肝癌惡性表型并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向肝細(xì)胞重編程;希望藉此探索腫瘤細(xì)胞重編程的可能性及其可能機(jī)理，為癌癥的治療提供新的思路與方向。
　　方法:
　　1.通過(guò)realtime-RCR檢測(cè)不同肝癌細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞中HNF1α、HNF4α和FOXA3的表達(dá)情況。
　　2.通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝癌組織芯片中HNF1α、HNF4α和FOXA3的表達(dá)情況。
　　3.分別構(gòu)建表達(dá)HNF1α、HNF4α和

6、FOXA3的三種腺病毒，并用realtime-PCR和蛋白印跡法(Western blot)驗(yàn)證表達(dá)三種因子的腺病毒感染肝癌細(xì)胞后的表達(dá)情況。
　　4.將HNF1α、HNF4α和FOXA3腺病毒感染肝癌細(xì)胞后，通過(guò)realtime-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞相關(guān)功能基因的表達(dá)水平。
　　5.通過(guò)相差顯微鏡觀察三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的形態(tài)改變。
　　6.利用基因芯片檢測(cè)并比較三因子誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞以及人原代肝細(xì)胞的基因表達(dá)差

7、異。
　　7.采用PAS、油紅染色、LDL攝取、尿素及白蛋白分泌等肝功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)三因子誘導(dǎo)后的肝癌細(xì)胞肝功能的改善情況。
　　8.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)三因子對(duì)肝癌干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
　　9.通過(guò)CCK8、克隆形成、transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性改善情況。
　　10.建立PDX(patient-derived xenograft)模型并通過(guò)瘤內(nèi)注射三因子腺病毒，研究

8、其體內(nèi)治療肝癌的效果。
　　結(jié)果:
　　1.不同肝癌細(xì)胞系中HNF1α、HNF4α和FOXA3三種肝細(xì)胞核因子的表達(dá)水平有較大差異。
　　2.肝癌樣本中的三因子表達(dá)存在異質(zhì)性，且大多數(shù)癌中三因子表達(dá)均低于癌旁。
　　3.聯(lián)合應(yīng)用HNF1α、HNF4α和FOXA3三種肝細(xì)胞核因子能上調(diào)肝癌細(xì)胞中大量肝功能相關(guān)基因表達(dá)，且三因子聯(lián)合應(yīng)用的效果顯著優(yōu)于HNF1α、HNF4α、FOXA3單因子及兩兩組合(1+4、1+F、

9、4+F)的效果。
　　4.經(jīng)三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的形態(tài)較對(duì)照細(xì)胞更加扁平寬大，接近肝細(xì)胞的形態(tài)。
　　5.基因芯片分析顯示三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞差異很大，其可以和人原代肝細(xì)胞聚類。
　　6.三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的肝細(xì)胞相關(guān)功能，如糖原合成、脂質(zhì)堆積、白蛋白攝入等較對(duì)照細(xì)胞得到很大改善。
　　7.三因子聯(lián)合應(yīng)用能顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞中肝癌干細(xì)胞的比例并抑制其自我更新能力。
　　8.經(jīng)三因子誘導(dǎo)后肝癌細(xì)胞的

10、惡性表型幾近消失。
　　9.PDX中注射三因子腺病毒可有效抑制肝癌生長(zhǎng)并能增強(qiáng)其ALB表達(dá)并降低AFP表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　HNF1α、HNF4α和FOXA3三種肝細(xì)胞核因子的在不同肝癌細(xì)胞中表達(dá)量差異較大,且大多數(shù)肝癌中三種因子表達(dá)均低;單一及兩兩組合的誘導(dǎo)效果遠(yuǎn)不及三種因子聯(lián)合應(yīng)用;經(jīng)過(guò)三因子誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞不僅其惡性生物學(xué)特性得到抑制，還表現(xiàn)出較好的肝細(xì)胞形態(tài)和功能，提示三因子聯(lián)合應(yīng)用可能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向肝細(xì)胞重編