β-arrestins在細胞凋亡和TLR4介導的先天性免疫反應中分子調(diào)控機制的研究.pdf

1、第一部分：β-arrestins負性調(diào)控細胞凋亡
　　目的:
　　研究β-arrestins在血清饑餓（SD）誘導的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）凋亡中的作用，以及相關信號轉(zhuǎn)導途徑。
　　方法:
　　WT，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs在無血清DMEM培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)12h、24h、48h后，TUNEL檢測細胞凋亡率。β-arrestin2 KO MEFs轉(zhuǎn)染β-arrest

2、in2過表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后，SD誘導12h，24h、48h，TUNEL檢測細胞凋亡情況。SD誘導12h、24h后，Westernblot檢測WT，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs內(nèi)Caspase-3、ERK1/2、p38MAPKs、Akt蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.SD誘導不同時間后，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs中凋亡細胞數(shù)目顯著多于W

3、T MEFs，并且在β-arrestin2 KO MEFs中轉(zhuǎn)染β-arrestin2質(zhì)粒后能夠明顯減少細胞的凋亡。
　　2. SD誘導不同時間后，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs中cleaved Caspase-3活性顯著高于WT MEFs。
　　3. SD誘導不同時間后，β-arrestin1 KO和β-arrestin2 KO MEFs中p-ERK1/2、p-p38MAPKs水平顯著

4、高于WT MEFs，而p-Akt則明顯低于WT MEFs。
　　結(jié)論：
　　1.β-arrestin1和2能夠顯著減少SD誘導的MEFs的凋亡。
　　2.β-arrestin1和2通過調(diào)控促凋亡蛋白ERK1/2、p38MAPKs和抗凋亡蛋白Akt的信號途徑參與SD介導的細胞凋亡信號通路的轉(zhuǎn)導。
　　第二部分:β-arrestins負性調(diào)控TLR4介導的先天性免疫反應
　　目的:
　　研究β-arres

5、tins在脂多糖（LPS）、IL-1β誘導的MEFs、HEK293細胞炎癥介質(zhì)產(chǎn)生中的作用，以及相關信號轉(zhuǎn)導途徑。
　　方法:
　　LPS刺激WT，β-arrestin1/2 DKO MEFs不同時間點后，RT-PCR測定細胞因子IL-6、IL-8和 TNF-α的表達水平。β-arrestin1/2 DKO MEFs分別轉(zhuǎn)染β-arrestin1或β-arrestin2過表達質(zhì)粒48h后，LPS刺激1h，RT-PCR及ELI

6、SA測定細胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達水平，Westernblot測定細胞內(nèi)ERK1/2、p38MAPKs、Akt的蛋白表達情況。IL-1β刺激HEK293細胞、轉(zhuǎn)染了β-arrestin1或2過表達質(zhì)粒的HEK293細胞及轉(zhuǎn)染了β-arrestin1或2 siRNA的HEK293細胞后，雙熒光素酶報告基因檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的活性。
　　結(jié)果:
　　1. LPS刺激后，β-arrestin1/2

7、DKO MEFs中IL-6、IL-8和TNF-α的表達水平顯著高于WT MEFs，并且在β-arrestin1/2 DKO MEFs中轉(zhuǎn)染β-arrestin1或β-arrestin2質(zhì)粒后能夠明顯減少IL-6、IL-8和TNF-α的表達水平。
　　2. LPS刺激后，β-arrestin1/2 DKO MEFs中p-ERK1/2、p-p38MAPKs水平顯著高于 WT MEFs，轉(zhuǎn)染β-arrestin1或β-arrestin2

8、質(zhì)粒后則能顯著抑制 p-ERK1/2、p-p38MAPKs的活性。
　　3. IL-1β刺激HEK293細胞后，能引起NF-κB及AP-1報告基因活性的增加，轉(zhuǎn)染β-arrestin1或β-arrestin2質(zhì)粒后能夠抑制報告基因活性的增加。而轉(zhuǎn)染了β-arrestin1或β-arrestin2 siRNA后則能進一步增加NF-κB及AP-1報告基因活性。
　　結(jié)論:
　　1.β-arrestin1和2能夠抑制LPS引

9、起的細胞因子的表達，負調(diào)控TLR4介導的先天性免疫反應。
　　2.β-arrestin1和2是通過抑制ERK、p38MAPKs來負調(diào)控TLR4的信號通路。
　　3.β-arrestin1和2能夠調(diào)控IL-1β引起的NF-κB及AP-1的激活
　　第三部分：β-arrestin2在TLR4介導的小鼠肝臟缺血再灌注損傷炎癥反應及細胞凋亡中的作用及機制研究
　　目的:
　　研究β-arrestin2在TLR4介導

10、的小鼠肝臟缺血再灌注損傷中的保護作用及其可能機制。
　　方法:
　　C57BL/6β-arrestin2 WT、KO雄性小鼠隨機分為四組，兩組對照組（WT、β-arrestin2 KO）和兩組實驗組（IR+WT、IR+β-arrestin2 KO）。制作小鼠肝臟熱缺血再灌注模型，再灌注6小時后處死小鼠，檢測肝臟功能、肝組織形態(tài)學、肝細胞凋亡、細胞因子、生存率等指標。Westernblot檢測TLR4、Akt/GSK3β， B

11、cl-2家族，MAPKs及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達。
　　結(jié)果:
　　1.再灌注6小時，β-arrestin2 KO組ALT、AST，細胞凋亡數(shù)目及細胞因子的產(chǎn)生顯著高于WT組，β-arrestin2 KO組小鼠生存率明顯低于WT組。
　　2. Westernblot檢測β-arrestin2 KO組 Akt/GSK、Bcl-2的活性顯著低于 WT組，而ERK1/2、p38MAPKs、NF-κB的活性高于WT組。