葡萄子原花青素B2抗內皮細胞糖基化損傷的作用機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分:GSPB2對內皮細胞糖基化損傷保護作用的研究
　　 研究背景:隨著社會經濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，生活方式的改變和社會人口老齡化，糖尿病患病率在世界范圍內呈上升趨勢，已經成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的又一嚴重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問題。糖尿病不僅僅以持續(xù)性的高血糖為其特點，更重要的是高血糖所帶來的血管并發(fā)癥的損害。血管內皮細胞(vascular endothelial cell

2、，VEC)是人體血管壁的第一道屏障，調節(jié)著血管的結構和功能，VEC是最早受到高血糖影響的部位，高血糖可抑制內皮細胞的遷移、增殖和血管發(fā)生變化；大量的研究證實：內皮功能障礙包括血管舒張因子與血管收縮因子、抗凝介質與促凝介質或生長抑制因子與生長促進因子之間的不平衡在VR的發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用。因此，血管早期損傷機制的闡明有助于預防或延緩糖尿病血管重構的發(fā)生和發(fā)展，并且VEC作為血管重構的干預點具有良好前景，開辟新的糖尿病血管并發(fā)癥治療

3、途徑具有重要意義。
　　 葡萄子原花青素(grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE)是從葡萄子中提取的一種天然多酚類化合物，是迄今為止所發(fā)現的最強效的自由基清除劑之一，具有強大的抗氧化、抗非酶糖基化活性，并具有強效的心血管保護作用；其作為一種天然植物成分，無明顯的毒性反應，在國內外的應用非常廣泛，其中二聚體在各類原花青素中分布最廣，抗氧化活性最強。葡萄子原花青素B2(grape seed

4、procyanidin B2，GSPB2)是GSPE的主要成分，由兩個單體(兒茶素或表兒茶素)C4→C8鍵合而成的二聚體，在8種異構體中原花青素B2的活性最強。多年來，國內外眾多學者一直致力于GSPE的作用機制研究。但是，至今尚未明確GSPB2對糖尿病血管內皮細胞糖基化損傷保護作用的機制研究。在目前的研究中，觀察糖基化終末產物對人臍靜脈內皮細胞的影響以及探討GSPB2對其的保護作用，并進一步研究乳凝集素(lactadherin)和糖原合

5、成酶激酶3β(GSK3β)信號通路在GSPB2抗內皮細胞糖基化損傷中的調節(jié)機制，將為防治糖尿病血管并發(fā)癥乃至多種涉及血管重構的疾病開辟新的途徑。
　　 研究目的:
　　 1.研究GSPB2對血管內皮細胞糖基化損傷的保護作用。
　　 2.研究GSPB2對乳凝集素和GSK3β表達的影響。
　　 研究方法:體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，加入不同濃度的GSPB2(0.78、1.56、3.12、6.25、

6、12.50、25.00、50.00μmol/L)孵育48小時，應用MTT和CCK-8比色法測定HUVEC的細胞生存率，從而確定實驗中GSPB2的使用濃度。將GSPB2溶液加入HUVEC中，終濃度為(2.5、5.0、10.0μmol/L)，預孵育1小時，然后加入糖基化終末產物(AGE-BSA，200μg/ml)繼續(xù)共同培養(yǎng)至48h。應用CCK-8比色法測定HUVEC的細胞生存率，流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞內活性氧簇(ROS)的形成，實時

7、定量PCR或Western blot技術測定各組細胞lactadherin、cleaved caspase3、caspase3、磷酸化GSK3β(ser9)和總GSK3β的表達。
　　 研究結果:
　　 1.GSPB2對HUVEC細胞存活率的影響不同濃度的GSPB2孵育48小時后，HUVEC的細胞生存率在GSPB2濃度≤12.5μmol/L較正常細胞增加，GSPB2在濃度為6.25μmol/L時HUVEC細胞生存率較正常

8、顯著增加(P<0.05)。并且當GSPB2濃度超過25.00μmol/L時HUVEC細胞生存率較正常顯著降低(P<0.05)。
　　 2.GSPB2對AGEs刺激HUVEC細胞存活率的影響與正常細胞組相比，AGEs顯著降低HUVEC的細胞存活率(P<0.01)。應用不同濃度的GSPB2(2.5、5.0、10.0μmol/L)和HUVEC預孵育后，能夠顯著改善AGEs刺激HUVEC的細胞生存率(P<0.05或P<0.01)。

9、>　　 3.GSPB2對AGEs刺激HUVEC細胞凋亡的影響與正常細胞組相比，AGEs顯著增加HUVEC的細胞凋亡(P<0.01)。應用不同濃度的GSPB2(2.5、5.0、10.0μmol/L)和HUVEC預孵育后，能夠顯著降低AGEs刺激HUVEC的凋亡(P<0.05)。
　　 4.GSPB2對AGEs刺激HUVEC細胞內ROS的影響與正常細胞組相比，AGEs刺激HUVEC0.5小時后，顯著增加細胞內ROS的形成(P<0.

10、05)。應用不同濃度的GSPB2(2.5、5.0、10.0μmol/L)和HUVEC預孵育后，能夠呈劑量依賴性的顯著降低AGEs刺激HUVEC的ROS形成(P<0.05)。
　　 5.GSPB2對AGEs刺激HUVEC的cleaved caspase3和lactadherin表達影響AGEs刺激HUVEC48小時后，cleaved caspase3和lactadherin蛋白表達與正常細胞相比顯著增加(P<0.05)。經不同濃度

11、GSPB2預孵育后能夠顯著降低AGEs刺激HUVEC的cleaved caspase3和lactadherin蛋白的表達，呈劑量依賴性(P<0.05)。同時應用實時定量PCRN定各組細胞lactadherin mRNA的表達，AGEs刺激HUVEC48小時，lactadherin mRNA的表達也顯著增加(P<0.05)，GSPB2能夠劑量依賴性的抑制lactadherin mRNA的表達(P<0.05)。
　　 6.GSPB2

12、對AGEs刺激HUVEC的磷酸化GSK3β(ser9)蛋白表達影響AGEs刺激HUVEC48小時后，磷酸化GSK3β(ser9)表達顯著降低(P<0.05)，經不同濃度GSPB2預孵育后能夠顯著增加AGEs刺激HUVEC的磷酸化GSK3β(ser9)蛋白表達(P<0.05)。
　　 結論:
　　 1.AGEs刺激HUVEC引起細胞凋亡，使lactadherin、cleaved caspase3表達增高，經不同濃度GSPB

13、2預孵育，能夠抑制HUVEC損傷，起到保護作用。
　　 2.GSPB2保護內皮細胞糖基化損傷的分子機制：可能通過抑制lactadherin和增加磷酸化GSK3β(ser9)蛋白表達有關。
　　 第二部分:Lactadlaerin介導的GSPB2抗內皮細胞糖基化損傷機制的研究
　　 研究背景:糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)是體內蛋白質中賴氨酸的氨基部分、脂

14、類或核酸與還原糖的羰基在無酶的條件下發(fā)生反應，形成Schiff堿，經Amadori反應重排后形成的相對穩(wěn)定的糖基化產物。近來研究發(fā)現，糖尿病患者血中AGEs水平明顯增高，且隨著病程的延長AGEs濃度也逐漸增加。AGEs具有廣泛的生物學活性，參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。在血管壁的聚集直接參與了血管病變的形成。同時，AGEs還與血管壁細胞膜上AGEs受體結合，激活與血管損傷相關的機制，最終導致血管損傷。但是，AGEs導致血管內皮細胞損

15、傷機制尚未闡明。
　　 我們通過第一部分研究發(fā)現，AGEs刺激血管內皮細胞導致乳凝集素(lactadherin)表達增高，經GSPB2干預后其表達呈劑量依賴性降低；前期通過蛋白質組學和分子生物學技術發(fā)現：在糖尿病大鼠主動脈組織中l(wèi)actadherin表達顯著增加，經GSPE干預后，其在主動脈組織中表達明顯降低。乳凝集素又稱為乳脂肪球表皮生長因子8(MFG-E8)是乳汁脂肪小球表面的親脂性糖蛋白，在機體其他體液中也有表達，發(fā)揮多種

16、功能，并與體內多種細胞的整合素受體結合，引發(fā)粘附、分化、增殖、凋亡、細胞骨架重排、激酶級聯反應等。它主要分布于乳小管頂端的分泌上皮，并在乳腺癌中過度表達；并且也存在于胰腺、主動脈內皮細胞和平滑肌細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞等。本研究首先構建lactadherin過表達慢病毒載體和siRNA，轉染HUVEC后，并應用GSPB2干預，測定干預前后內皮細胞凋亡變化，并應用分子生物學技術檢測lactadherin、cleaved caspase3

17、、Bax/Bcl-2和磷酸化GSK3B(ser9)表達變化。
　　 研究目的:
　　 1.研究lactadherin siRNA和過表達對內皮細胞糖基化損傷的影響。
　　 2.研究GSPB2抗內皮細胞糖基化損傷的分子調控機制。
　　 研究方法:體外培養(yǎng)HUVEC，構建lactadherin siRNA和過表達載體，成功轉染HUVEC后，傳代擴增。將轉染陰性對照和lactadherin siRNA的HUVE

18、C分別加入糖基化終末產物(AGE-BSA，200μg/ml)繼續(xù)共同培養(yǎng)至48h，陰性對照同時加入GSPB2(10.00μmol/L)共孵育；另外，將lactadherin過表達的HUVEC，加入GSPB2(10.00μmol/L)孵育48小時，應用MTT和CCK-8比色法測定各組細胞生存率，TUNEL法檢測細胞凋亡，并收集lactadherin過表達的HUVEC，各組細胞應用電鏡觀察細胞超微結構變化，應用實時定量PCR或Western

19、 blot技術測定各組細胞lactadherin、cleaved caspase3、磷酸化GSK3β和線粒體凋亡通路Bax/Bcl-2表達變化。
　　 研究結果:
　　 1.Lactadherin siRNA和過表達轉染HUVEC的有效性轉染的有效性應用熒光顯微鏡、實時定量PCR和western blot技術評價。轉染陰性對照組(NC)、lactadherin siRNA組(LsiRNA)、表達GFP基因組(LV-C)和

20、GFP及l(fā)actadherin過表達組(LV)，收獲各組細胞。轉染有效性約為95％，lactadherin siRNA在轉染后48小時LsiRNA lactadherin蛋白表達較NC降低60％以上；lactadherin過表達在轉染5天后，lactadherin蛋白表達量較LV-C增加超過2倍。
　　 2.Lactadherin對AGEs刺激HUVEC細胞生存率的影響及GSPB2干預作用HUVEC轉染GFP基因或陰性對照并未影

21、響細胞生存率。AGEs(200μg/ml)刺激各組細胞48小時，與AGEs刺激NC組細胞相比，LsiRNA能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細胞生存率的降低(P<0.05)；GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時也能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細胞生存率的降低(P<0.05)。另外，轉染5天后，LV組細胞生存率較LV-C組顯著降低(P<0.05)，GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時能夠顯著改善LV組細胞生存率(P<0.05)。

22、>　　 3.Lactadherin對AGEs刺激HUVEC細胞凋亡的影響及GSPB2干預作用AGEs(200μg/ml)刺激各組細胞48小時后，與AGEs刺激NC組細胞相比，LsiRNA能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細胞凋亡(P<0.05)；GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時也能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細胞凋亡(P<0.05)。另外，轉染5天后，LV組細胞凋亡較LV-C組顯著增加(P<0.05)，GSPB2(10μmol/L)共

23、孵育48小時能夠顯著改善LV組細胞凋亡(P<0.05)。
　　 4.Lactadherin過表達HUVEC超微結構的改變透射電鏡掃描觀察Lactadherin過表達轉染5天后及GSPB2共孵育48小時細胞超微結構改變，LV組細胞凋亡顯著增加，可見凋亡小體、線粒體偏極化、細胞染色質固縮及染色體聚集于核膜呈境界分明塊狀等變化，GSPB2共孵育后細胞凋亡顯著減輕。
　　 5.Lactadherin對AGEs刺激HUVEC的cl

24、eaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值影響及GSPB2干預作用LV-C組、LV組、LsiRNA組和NC組細胞uncleaved caspase-3表達未見顯著變化。AGEs(200μg/ml)刺激各組細胞48小時后，與AGEs刺激NC組細胞相比，LsiRNA能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值的增加(P<0.05)；GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時也能夠顯著

25、改善AGEs誘發(fā)的細胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值的增加(P<0.05)。另外，轉染5天后，LV組細胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值較LV-C組顯著增加(P<0.05)，GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時也能夠顯著改善LV組細胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值的增加(P<0.05)。
　　 6.Lactadherin對AGEs刺激HUV

26、EC磷酸化GSK3β(ser9)的影響及GSPB2干預作用AGEs(200μg/ml)刺激各組細胞48小時后，與AGEs刺激NC組細胞相比，LsiRNA能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細胞磷酸化GSK3β(ser9)的降低(P<0.05)；GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時也能夠顯著改善AGEs誘發(fā)的細胞磷酸化GSK3β(ser9)的降低(P<0.05)。另外，轉染5天后，LV組細胞磷酸化GSK3β(ser9)較LV-C組顯著降低(

27、P<0.05)，GSPB2(10μmol/L)共孵育48小時能夠顯著改善LV組細胞磷酸化GSK3β(ser9)的降低(P<0.05)。
　　 結論:
　　 1.Lactadherin在AGEs誘發(fā)的血管內皮細胞凋亡中起著重要的作用。
　　 2.Lactadherin介導的血管內皮細胞凋亡與線粒體凋亡通路和GSK3β(ser9)的磷酸化有關。
　　 3.抗氧化劑GSPB2通過抑制Lactadherin表達起