仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力對(duì)小口徑組織工程血管的生物學(xué)作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　1、制造小口徑組織工程血管是當(dāng)前的研究熱點(diǎn),仿生應(yīng)力對(duì)小口徑組織工程血管的生長(zhǎng)和成熟非常重要,但目前的很多灌注培養(yǎng)式生物反應(yīng)器尚不能提供模擬生理血流的動(dòng)力學(xué)環(huán)境,而且未提供足夠的生物學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)證明其優(yōu)越性;
　　2、小口徑組織工程血管的功能和生物力學(xué)特性都離不開(kāi)平滑肌細(xì)胞的良好增殖,但平滑肌細(xì)胞在接種到支架材料后的增殖情況并不令人滿意,從而影響小口徑組織工程血管的功能和生物力學(xué)強(qiáng)度。
　　目的:
　　1

2、、構(gòu)建小口徑組織工程血管,體外仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力條件下進(jìn)行培養(yǎng),觀察對(duì)小口徑組織工程血管的生物學(xué)作用;
　　2、構(gòu)建平滑肌細(xì)胞受仿生搏動(dòng)應(yīng)力模型,探討仿生搏動(dòng)應(yīng)力促平滑肌細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　1、(1)酶消化法分離獲得內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),VIII因子相關(guān)抗原免疫組化染色和α肌動(dòng)蛋白免疫熒光染色分別鑒定內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的表型;
　　(2)用不使用胰酶的化學(xué)方法制備脫細(xì)胞

3、兔主動(dòng)脈支架材料,觀察大體形態(tài),行組織學(xué)觀察、掃描電鏡和透射電鏡觀察,CCK-8法評(píng)價(jià)生物相容性,計(jì)算接種細(xì)胞黏附率,評(píng)價(jià)親水性,接種內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞后行組織學(xué)觀察、掃描電鏡和透射電鏡觀察;
　　(3)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞接種到脫細(xì)胞兔主動(dòng)脈,構(gòu)建小口徑組織工程血管,置入我們自行研制的小口徑組織工程血管生物反應(yīng)器,分別給予仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力和靜態(tài)培養(yǎng)后檢測(cè):觀察大體形態(tài),行HE染色、Masson染色和彈力纖維染色,掃描電鏡觀察,

4、Real-timePCR檢測(cè)CollagenI、III、IV、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮素-1mRNA表達(dá),免疫熒光檢測(cè)鈣調(diào)蛋白、α肌動(dòng)蛋白、VIII因子相關(guān)抗原和血管性假性血友病因子,NO和6-keto-PGF1a濃度檢測(cè),血小板黏附實(shí)驗(yàn),生物力學(xué)檢測(cè)。
　　2、(1)分組:①動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組;②靜態(tài)培養(yǎng)組;③動(dòng)態(tài)培養(yǎng)+慢病毒組;④靜態(tài)培養(yǎng)+慢病毒組;⑤動(dòng)態(tài)培養(yǎng)+IGF-1RsiRNA組;⑥靜態(tài)培養(yǎng)+IGF-1RsiRNA組。檢測(cè):

5、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡,Real-timePCR檢測(cè)IGF-1R、骨橋蛋白mRNA,WesternBlot檢測(cè)IGF-1R、骨橋蛋白、pTyr-IGF-1R、p-AKT;
　　(2)分組:①動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組;②靜態(tài)培養(yǎng)組。檢測(cè):microRNA芯片檢測(cè),microRNA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè),Real-timePCR檢測(cè)差異表達(dá)的microRNA;
　　(3)分組:①動(dòng)態(tài)培養(yǎng)組;②靜態(tài)培養(yǎng)組;③動(dòng)態(tài)培養(yǎng)+慢病毒組;④靜態(tài)培養(yǎng)+慢病毒組;

6、⑤動(dòng)態(tài)培養(yǎng)+microRNA-223組;⑥靜態(tài)培養(yǎng)+microRNA-223組;⑦動(dòng)態(tài)培養(yǎng)+microRNA-153組;⑧靜態(tài)培養(yǎng)+microRNA-153組。檢測(cè):靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡,Real-timePCR檢測(cè)IGF-1R、骨橋蛋白mRNA,WesternBlot檢測(cè)IGF-1R、骨橋蛋白、pTyr-IGF-1R、p-AKT。
　　結(jié)果:
　　1、(1)平滑肌細(xì)胞成束平行的排列,呈典型的“峰與谷

7、”樣生長(zhǎng),α肌動(dòng)蛋白免疫熒光呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性;內(nèi)皮細(xì)胞呈典型的“鵝卵石”樣生長(zhǎng),排列密集,VIII因子相關(guān)抗原免疫組化染色為強(qiáng)陽(yáng)性;
　　(2)①脫細(xì)胞兔主動(dòng)脈質(zhì)地與新鮮兔主動(dòng)脈相比無(wú)明顯變化;②HE染色:結(jié)構(gòu)疏松,質(zhì)地均勻,自身細(xì)胞基本完全脫除;Masson染色:結(jié)構(gòu)疏松,膠原纖維之間可見(jiàn)較多空隙;彈力纖維染色:結(jié)構(gòu)疏松,彈力纖維之間可見(jiàn)較多空隙;③掃描電鏡檢測(cè):外表面毛糙,主要由粗大的膠原纖維交織而成,孔隙比內(nèi)表面多,內(nèi)表面光滑;④

8、對(duì)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)為0~1級(jí);⑤平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率分別為64.32％±2.03%和52.77%±1.19%;⑥種子細(xì)胞-脫細(xì)胞兔主動(dòng)脈復(fù)合物的檢測(cè):HE染色:平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)良好,并有部分遷移至管壁內(nèi)部,內(nèi)皮細(xì)胞附著于內(nèi)表面,生長(zhǎng)良好;掃描電鏡:外表面和內(nèi)表面均被平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞附著,并且部分平滑肌細(xì)胞向支架表面的孔隙內(nèi)生長(zhǎng);透射電鏡:平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)富含肌絲,縱向平行排列,胞內(nèi)有密斑和密體,內(nèi)皮細(xì)胞間存在

9、細(xì)胞連接,胞漿內(nèi)可見(jiàn)W-P小體;⑦親水性:浸泡15分鐘后吸水率227±21.2%,浸泡12小時(shí)后飽和(519%±23%),而后維持在這一水平;
　　(3)①仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的小口徑組織工程血管管腔通暢,色澤與天然血管接近;②HE染色:仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖的數(shù)量較靜態(tài)培養(yǎng)的數(shù)量更多;③掃描電鏡:仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞向鄰近的細(xì)胞伸出很多突起相連,靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞沿著支架形成紡錘形狀

10、,細(xì)胞數(shù)量也非常少;仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管管腔內(nèi)面形成更完整的單層內(nèi)皮細(xì)胞層,并更廣泛的分布;④彈力纖維染色:天然血管和仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中染色較為豐富;Masson染色:膠原表達(dá)沒(méi)有顯著差異;Real-timePCR檢測(cè):仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞CollagenI、III和IV基因表達(dá)水平明顯升高;⑤免疫熒光檢測(cè):仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中,平滑肌細(xì)胞沿環(huán)形方向伸展排列,Calponin和a-actin免疫熒光強(qiáng)

11、度更強(qiáng),數(shù)量更多;仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中,內(nèi)皮細(xì)胞幾乎鋪滿管腔內(nèi)壁,VIII因子相關(guān)抗原和血管性假性血友病因子免疫熒光強(qiáng)度更強(qiáng),內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量更多;⑥Real-timePCR檢測(cè):仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮素-1mRNA的表達(dá)較靜態(tài)培養(yǎng)明顯升高;⑦NO和6-keto-PGF1a檢測(cè):仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管的內(nèi)皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量NO和6-keto-PGF1a,數(shù)量比靜態(tài)培養(yǎng)更接近天然血管;⑧血小板黏附

12、實(shí)驗(yàn):在仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管的管腔內(nèi)面粘附的血小板很少;⑨力學(xué)特性:仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力培養(yǎng)的血管的拉伸彈性恢復(fù)率、斷裂伸長(zhǎng)率、抗拉強(qiáng)度明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)的血管。
　　2、(1)①動(dòng)態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞,與靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng),凋亡明顯減弱;動(dòng)態(tài)培養(yǎng)干擾IGF-1RmRNA翻譯后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,細(xì)胞增殖明顯減弱,凋亡明顯增強(qiáng);②Real-timePCR檢測(cè):動(dòng)態(tài)培養(yǎng)靜脈

13、平滑肌細(xì)胞,與靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,IGF-1RmRNA的表達(dá)明顯上調(diào);動(dòng)態(tài)培養(yǎng)干擾IGF-1RmRNA翻譯后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,IGF-1RmRNA的表達(dá)明顯下調(diào);③WesternBlot檢測(cè):動(dòng)態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞,與靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,IGF-1R、pTyr-IGF-1R、p-AKT的表達(dá)明顯上調(diào);動(dòng)態(tài)培養(yǎng)干擾IGF-1RmRNA翻譯后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞相

14、比較,IGF-1R、pTyr-IGF-1R、p-AKT的表達(dá)明顯下調(diào);
　　(2)①動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞組中篩選出2個(gè)表達(dá)上調(diào)2倍以上的microRNA,6個(gè)表達(dá)下調(diào)2倍以上的microRNA;②Real-timePCR對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,microRNA-153的表達(dá)在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞中約為靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞中的1/2,microRNA-223的表達(dá)在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞中約為靜態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞中的1/4;③

15、Real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng),microRNA-153和microRNA-223的表達(dá)呈下降趨勢(shì),并均在4小時(shí)達(dá)到最低,此后microRNA-153和microRNA-223的表達(dá)一直維持在最低水平;
　　(3)①EGFP/RFP報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示:IGF-1R是microRNA-153和microRNA-223作用的靶基因,并且microRNA-223對(duì)靶基因IGF-1R的調(diào)控作用強(qiáng)于microRNA-153;②

16、Real-timePCR檢測(cè):靜態(tài)培養(yǎng)microRNA-153和microRNA-223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與靜態(tài)培養(yǎng)的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,microRNA-153和microRNA-223的表達(dá)明顯上調(diào),上調(diào)約4倍左右;動(dòng)態(tài)培養(yǎng)microRNA-153和microRNA-223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與靜態(tài)培養(yǎng)microRNA-153和microRNA-223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,microRNA-153和m

17、icroRNA-223的表達(dá)明顯下調(diào);③動(dòng)態(tài)培養(yǎng)microRNA-153和microRNA-223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,細(xì)胞增殖明顯減弱,凋亡明顯增強(qiáng);動(dòng)態(tài)培養(yǎng)microRNA-223轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)microRNA-153轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,細(xì)胞增殖減弱更加明顯,凋亡增強(qiáng)更加明顯;④Real-timePCR檢測(cè):動(dòng)態(tài)培養(yǎng)microRNA-153和microRNA-223

18、分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,IGF-1RmRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異;動(dòng)態(tài)培養(yǎng)microRNA-223轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)microRNA-153轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,IGF-1RmRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異;⑤WesternBlot檢測(cè):動(dòng)態(tài)培養(yǎng)microRNA-153和microRNA-223分別轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,IGF-1R的表達(dá)明顯下調(diào);動(dòng)態(tài)培養(yǎng)

19、microRNA-223轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞,與動(dòng)態(tài)培養(yǎng)microRNA-153轉(zhuǎn)染后的靜脈平滑肌細(xì)胞相比較,IGF-1R、pTyr-IGF-1R、p-AKT的表達(dá)下調(diào)更加明顯。
　　結(jié)論:
　　1、酶消化法分離內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞方法簡(jiǎn)單可行,細(xì)胞獲取率高,獲得細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和免疫表型符合內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特征;
　　2、用不使用胰酶的化學(xué)方法制備脫細(xì)胞兔主動(dòng)脈支架材料,方法簡(jiǎn)便可行,制備的脫細(xì)胞兔主動(dòng)脈支架材

20、料的親水性、細(xì)胞黏附性、細(xì)胞相容性和組織學(xué)等特性均適合作為小口徑組織工程血管的支架材料;
　　3、仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力可以有效促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖并引導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的同向排列和內(nèi)皮細(xì)胞的均勻分布,可能會(huì)引導(dǎo)小口徑組織工程血管形成接近于天然血管的組織結(jié)構(gòu);仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力可以有效促進(jìn)膠原和彈力纖維的分泌,可能會(huì)引導(dǎo)小口徑組織工程血管具備接近于天然血管的生物力學(xué)性能;仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力可以有效促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞成熟表型的表達(dá)和細(xì)

21、胞因子的分泌,可能會(huì)引導(dǎo)小口徑組織工程血管向天然血管的方向成熟分化;仿生搏動(dòng)流體應(yīng)力可以有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞舒張血管和抗血栓形成功能的發(fā)揮,可能會(huì)引導(dǎo)小口徑組織工程血管擁有接近于天然血管的舒張血管和抗血栓形成能力;
　　4、IGF-1R的表達(dá)上調(diào)、活性及其下游信號(hào)通路激活在仿生搏動(dòng)應(yīng)力促進(jìn)靜脈平滑肌細(xì)胞的增殖和減少其凋亡中起重要作用;
　　5、仿生搏動(dòng)應(yīng)力可以促進(jìn)靜脈平滑肌細(xì)胞IGF-1R相關(guān)的microRNA-223和micr