糖尿病腎病模型鼠腎組織TGF-β-c-myc表達(dá)關(guān)系及冬蟲夏草對其表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，在西方國家，糖尿病腎病(DN)已成為終末期腎臟疾病(ESRD)的主要病因。據(jù)我國1999年首次透析移植登記報(bào)告結(jié)果顯示，糖尿病腎病占血液透析患者的13.5％，僅次于慢性腎小球腎炎，居第二位[1]。資料表明，近年來由于中國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們生活水平提高，飲食結(jié)構(gòu)變化，DM的發(fā)病率在逐年增加，專家們預(yù)測21世紀(jì)DN將是ESRD的最重要的發(fā)病原因。由于糖尿病腎病診治的醫(yī)療費(fèi)用昂

2、貴，且治療效果欠佳，特別是DN出現(xiàn)慢性腎衰后由于透析腎移植而給國家、社會(huì)及患者家人帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)是日趨突出的社會(huì)問題。因此，如何早期發(fā)現(xiàn)DN、早期采取防治措施能有效地延緩DN病程的進(jìn)展，已成為當(dāng)今人們倍為關(guān)注的課題。 轉(zhuǎn)化生因子-β(transforminggrowthfactor-β)是DM發(fā)展為DN的核心問題，它與腎臟固有細(xì)胞增殖、腎小球肥大、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增多密切相關(guān)[2]。已有大量研究證實(shí)，TGF-β在DN發(fā)病

3、過程中的起到了重要作用。如TGF-β可通過氧化應(yīng)激、葡萄糖激酶、Ang-Ⅱ等細(xì)胞因子激活后促使腎小球系膜細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、足細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而腎小球肥大、ECM聚積，最終出現(xiàn)腎小球纖維化。雖然隨著DN發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，取得了許多可喜的成果，但迄今為止DN的確切發(fā)病機(jī)制仍不甚清楚，特別是TGF-β通過哪幾個(gè)信號通路激活后最終將何種信息傳導(dǎo)給何種靶基因，從而促使腎組織內(nèi)膠原合成增加、ECM聚積等問題，目前仍是從事DM及DN

4、研究工作者感到困惑的問題。 c-myc是一種原癌基因，它廣泛分布于人體正常細(xì)胞內(nèi)，通常情況下c-myc在腎組織中只有低水平表達(dá)或不表達(dá)[3]。應(yīng)用脂多糖(LPS)、血小板衍生生長因子(PDGF)等有絲分裂原刺激早期生長的細(xì)胞以及組織損傷后處于再生修復(fù)期的細(xì)胞，此時(shí)組織細(xì)胞的c-myc表達(dá)將增強(qiáng)，提示c-myc表達(dá)與細(xì)胞增殖有密切的關(guān)系，說明c-myc可能直接參與細(xì)胞生長周期的調(diào)控。c-myc表達(dá)產(chǎn)物可特異性地與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合，

5、加速細(xì)胞周期從G1-S期轉(zhuǎn)變[4]。國外文獻(xiàn)報(bào)道，心肌細(xì)胞內(nèi)c-myc基因表達(dá)增加與心肌肥厚有關(guān)，c-myc表達(dá)變化可能是心肌肥厚時(shí)一系列信號介導(dǎo)過程的一部分[5]。有學(xué)者的體外研究顯示，應(yīng)用c-myc反義寡聚脫氧核苷酸中止c-myc表達(dá)，可阻斷這一過程，使細(xì)胞增殖停止；而重新活化c-myc表達(dá)又可使細(xì)胞繼續(xù)循細(xì)胞周期進(jìn)行增殖[6]；國內(nèi)劉志紅教授等研究發(fā)現(xiàn)，急性腎損傷鼠模型通過冬蟲夏草治療后，腎小管上皮細(xì)胞c-myc持續(xù)高表達(dá)，c-m

6、yc促進(jìn)腎小管上細(xì)胞增殖從而使損傷的腎小管上細(xì)胞得到及時(shí)修復(fù)[7]。上述研究均表明，c-myc基因直接參與細(xì)胞增殖與生長的調(diào)控[8]。隨著對c-myc基因研究的深入，特別是c-myc基因在細(xì)胞分裂增殖及修復(fù)過程中所發(fā)揮的作用，人們也開始對c-myc在慢性腎臟疾病中及DN的作用及c-myc與TGF-β兩者之間的關(guān)系倍感興趣。有研究顯示，TGF-β可通過多種途徑調(diào)節(jié)c-myc的表達(dá)，如應(yīng)用TGF-β抑制劑或抗體可下調(diào)c-myc的表達(dá)[9.1

7、0]，并抑制腎小球肥大。根據(jù)他人研究的結(jié)果表明，TGF-β具有調(diào)控c-myc基因表達(dá)的作用，而諸多的研究證明TGF-β在DN發(fā)病機(jī)制中起到了十分重要的作用，c-myc是否與DN發(fā)生有直接聯(lián)系?c-myc是否作為TGF-β下游靶基因而發(fā)揮生物效應(yīng)?干預(yù)c-myc基因表達(dá)后能否起到阻止DN發(fā)生發(fā)展或起到保護(hù)腎功能作用?是本研究擬重點(diǎn)探討的問題。因此本研究通過制備糖尿病腎病大鼠模型，觀察鼠腎組織TGF-β、c-myc基因表達(dá)狀況，并采用冬蟲夏

8、草進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)，以觀察冬蟲夏草對STZ鼠腎組織TGF-β、c-myc基因表達(dá)的影響，了解c-myc在DN發(fā)病中所發(fā)揮的作用，從而進(jìn)一步探討DN的發(fā)病機(jī)制，為DN早期防治及開發(fā)冬蟲夏草制劑在DN早期治療中臨床應(yīng)用而提供理論依據(jù)。 目的：①研究糖尿病腎病模型鼠腎組織TGF-β與c-myc的表達(dá)狀況及二者之間的關(guān)系，探討c-myc基因在DN發(fā)病中的作用和意義；②研究冬蟲夏草對TGF-β與c-myc基因表達(dá)的影響，為DN早期防治提供理論

9、依據(jù)。 方法：將30只鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型，隨機(jī)分為2組：D組為糖尿病腎病未干預(yù)組(15只)；C組為糖尿病腎病冬蟲夏草干預(yù)組(15只)，另將15只鼠齡、體重相匹配的大鼠作為N組即正常對照組。糖尿病腎病模型制備成功后開始給予藥物干預(yù)試驗(yàn)，即C組冬蟲夏草1.0g·kg-1·d-1，每上午灌胃1次，連續(xù)2-6周，冬蟲夏草干預(yù)后第2-6周將各組實(shí)驗(yàn)鼠置代謝籠內(nèi)收集24h尿；然后從處死鼠心臟取血，離心上清液-70℃保存；并分

10、離出雙腎，左腎稱重，記錄其重量，取右腎組織石蠟包埋后切片進(jìn)行特殊染色，觀察腎組織結(jié)構(gòu)變化并用免疫組化方法檢測大鼠腎臟TGF-β、c-myc的表達(dá)水平并進(jìn)行二者相關(guān)分析。 結(jié)果：①與正常對照組比較DN大鼠除24h尿蛋白排泄量增加，血肌酐(Scr)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)均升高外、血TGF-β、血Col-Ⅳ水平亦上升；②STZ鼠腎組織采用HE、masson染色觀察到DN大鼠腎小球肥大、ECM增多，腎間質(zhì)纖維化、部分腎間質(zhì)

11、有大量炎性細(xì)胞浸潤；③采用免疫組化方法檢測到DN大鼠腎組織TGF-β、c-myc呈現(xiàn)高表達(dá)；冬蟲草干預(yù)治療后腎組織TGF-β、c-myc表達(dá)下調(diào)。④冬蟲夏草干預(yù)后DN大鼠尿蛋白排泄量減少；血Scr、血CHO、血TGF-β、血Col-Ⅳ等指標(biāo)均降低；HE、masson特殊染色下觀察到系膜基質(zhì)增多狀況好轉(zhuǎn)，腎間質(zhì)纖維化有所減輕，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤減少；免疫組化結(jié)果示腎組織TGF-β、c-myc表達(dá)下調(diào)，且二者呈正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論：①D

12、N模型大鼠除尿蛋白排泄量增加腎功能異常、血脂升高以外還出現(xiàn)血TGF-β、血Col-Ⅳ水平異常；②DN大鼠可有病理結(jié)構(gòu)異常如系膜細(xì)胞基質(zhì)增多，間質(zhì)病變，這些結(jié)構(gòu)改變均是DN早期腎纖維化表現(xiàn)的基本病理改變；③DN大鼠腎組織在TGF-β表達(dá)上調(diào)同時(shí)c-myc亦表達(dá)上調(diào)，二者呈正相關(guān)關(guān)系，推測DN時(shí)TGF-β有可能通過c-myc作為靶基因而促使ECM合成增加；④冬蟲夏草可使TGF-β及c-myc表達(dá)下調(diào)，這可能是冬蟲夏草保護(hù)DN腎功能的機(jī)制所在