氨溴索對粘液型銅綠假單胞菌生物膜的干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分氨溴索對粘液型銅綠假單胞菌生物膜結(jié)構(gòu)的影響[目的]建立銅綠假單胞菌生物膜(biofilm，BF)模型，研究氨溴索對粘液型銅綠假單胞菌成熟BF的結(jié)構(gòu)影響。 [方法]平板培養(yǎng)法培養(yǎng)銅綠假單胞菌7天，得到成熟BF，用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察氨溴索對BF形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響；激光共聚焦顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)結(jié)合BF

2、圖像結(jié)構(gòu)分析軟件(Image Structure Analyer，ISA)對BF結(jié)構(gòu)參數(shù)分析；熒光顯微鏡定性觀察氨溴索對BF內(nèi)活菌的作用，并測定氨溴索單獨(dú)作用以及與環(huán)丙沙星聯(lián)用后BF內(nèi)活菌的熒光強(qiáng)度。 [結(jié)果]氨溴索作用后電鏡觀察可見BF被破壞，基質(zhì)樣物變稀疏，僅見少量散在細(xì)菌。ISA軟件定量分析顯示：氨溴索2mg/ml作用后，BF厚度、平均擴(kuò)散距離(Average Diffusion Distance，ADD)和結(jié)構(gòu)熵(Tex

3、tual Entropy，TE)均分別由39.22±2.01，1.08±0.001和6.25±0.22減少到10.09±2.32，1.00±0.002和5.19±0.41(p＜0.05)；區(qū)域孔率(arealporosity，AP)0.70±0.03增加0.91±0.02(p＜0.05)。0.75mg/ml氨溴索干預(yù)后，有同樣趨勢，但效應(yīng)不如高濃度明顯：BF厚度，AP，ADD和TE變化為20.10±2.86，0.82±0.04，1.03

4、±0.004和5.36±0.34(p＜0.05)。用熒光顯微鏡定性觀察，當(dāng)氨溴索濃度大于0.49mg/ml時，BF內(nèi)活菌數(shù)減少。同時，氨溴索與環(huán)丙沙星存在協(xié)同作用(F=15.1，p＜0.05)，且隨著氨溴索濃度升高，協(xié)同作用增強(qiáng)。 [結(jié)論]氨溴索可影響銅綠假單胞菌成熟BF形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)抗生素的殺菌活性。[目的]探討氨溴索對銅綠假單胞菌臨床分離株形成的BF主要成分藻酸鹽的干預(yù)作用。研究其對藻酸鹽合成過程中起重要作用的基因表達(dá)和合成過

5、程中限速酶活性的影響，以及其對藻酸鹽降解的影響。 [方法]建立銅綠假單胞菌臨床分離株BF體外模型，培養(yǎng)7天后得到成熟BF。將BF內(nèi)的細(xì)菌振蕩下來后，用硫酸-苯酚法檢測氨溴索對藻酸鹽含量的影響；RT-PCR檢測藻酸鹽合成過程中重要基因algD，algU，algR，mucA的mRNA表達(dá)；分光光度計(jì)檢測合成過程中限速酶-GDP-甘露糖脫氫酶(guanosine diphospho-D-mannose dehydrogenase，GM

6、D)的活性，并檢測藻酸鹽的降解情況。 [結(jié)果]生理鹽水對照組與氨溴索3.75mg/ml作用組比較，藻酸鹽含量(mg/g)由86.4024±0.8588下降到59.9199±0.5803(F=66.2，p＜0.01)；其合成重要基因algD，algU，algR，mucA的mRNA的表達(dá)分別由1.2994±0.0173，1.0488±0.0457，0.9888±0.0267和0.8731±0.0336變化為1.0253±0.0265

7、，0.9594±0.0106，0.8536±0.0179和1.0770±0.0503(F=91.9，41.1，88.4和56.9，p均＜0.05)；其合成限速酶GMD活性由0.0989±0.0055下降到0.0558±0.0016(F=121.2，p＜0.01)；藻酸鹽的降解量(△mg/g)由1.4122±0.0073變化為1.4175±0.0019(F=21.81，p＞0.05)。1.875mg/ml氨溴索組有同樣的趨勢但效應(yīng)不如高濃

8、度明顯。 [結(jié)論]氨溴索可以降低銅綠假單胞菌BF藻酸鹽的含量，影響藻酸鹽合成過程中重要基因algD，algU，algR，mucA的mRNA的表達(dá)，降低藻酸鹽合成限速酶GMD活性，但對藻酸鹽的降解無影響。[目的]探討氨溴索對野生型銅綠假單胞菌在用雙氧水刺激下向粘液型轉(zhuǎn)換的抑制作用。 [方法]分別用亞致死量雙氧水及雙氧水加氨溴索作用于野生型銅綠假單胞菌后，觀察野生型銅綠假單胞菌形態(tài)的變化，基因測序法檢測mucA基因的突變情況

9、及硫酸一苯酚法檢測藻酸鹽含量的變化。 [結(jié)果]在雙氧水的持續(xù)刺激下，野生型銅綠假單胞菌變?yōu)檎骋盒?，菌落形態(tài)由干燥規(guī)則變得濕潤肥大，邊界不規(guī)則；基因測序發(fā)現(xiàn)mucA基因出現(xiàn)了多個位點(diǎn)的錯義突變，藻酸鹽含量由不能檢出變化為69.6226±0.7652mg/g。同時加入雙氧水和氨溴索后，野生型銅綠假單胞菌的形態(tài)和mucA基因序列均未發(fā)生變化，藻酸鹽含量仍不能檢出。 [結(jié)論]氨溴索可以對抗雙氧水的作用，阻止野生型銅綠假單胞菌向粘

10、液型銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)換。 [目的]建立大鼠導(dǎo)管相關(guān)性粘液型銅綠假單胞菌生物膜感染模型，探討氨溴索對粘液型銅綠假單胞菌生物膜的體內(nèi)干預(yù)作用及對生物膜引起的肺部感染的影響。 [方法]建立銅綠假單胞菌臨床分離株BF體外模型，培養(yǎng)7天后得到成熟BF。將BF植入大鼠氣管建立大鼠導(dǎo)管相關(guān)性粘液型銅綠假單胞菌生物膜感染模型，分為BF感染組，BF氨溴索干預(yù)組，空白導(dǎo)管對照組和正常對照組。分別在植入后第4天和第7天處死大鼠，取出導(dǎo)管通過掃描

11、電鏡觀察導(dǎo)管上BF的結(jié)構(gòu)改變，檢測導(dǎo)管上藻酸鹽的含量并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；觀察肺部大體改變并評分，將部分肺組織進(jìn)行HE染色觀察病理改變，并檢測肺組織勻漿和血漿中藻酸鹽抗體，IFN-γ和IL-10的含量。 [結(jié)果]成功建立大鼠導(dǎo)管相關(guān)性粘液型銅綠假單胞菌生物膜感染模型。在兩個時間點(diǎn)BF感染氨溴索干預(yù)組大鼠氣管導(dǎo)管上的BF結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)管上BF內(nèi)的細(xì)菌減少，在術(shù)后4天和7天BF感染氨溴索干預(yù)組和BF感染組菌落計(jì)數(shù)分別為8.3494±0.0

12、25 lgCFU VS 8.5669±0.11lgCFU和8.1527±0.015 lgCFU VS 8.5009±0.013 lgCFU(F=87.6和F=507.5.p＜0.05)。BF藻酸鹽的含量也減少，術(shù)后4天和7天BF感染氨溴索干預(yù)組和BF感染組藻酸鹽含量分別為553776±0.842mg/g VS83.4886±0.0538mg/g和42.3721±0.505mg/g VS 74.6215±0.215mg/g(F=791.7

13、和F=3450.9，p＜0.05)。 BF感染氨溴索干預(yù)組和BF感染組肺部大體改變及肺組織病理變化，肺部大體改變指數(shù)(lung index of macroscopic pathology，LIMP)積分在術(shù)后第4天分別為0.1857±0.018和0.1929±0.025(F=2.0，p＞0.05)；在術(shù)后第7天前者較后者降低，分別為0.1928±0.024和0.2357±0.031(F=4.9，p＜0.05)。肺部菌落計(jì)數(shù)顯示BF感染

14、氨溴索干預(yù)組和BF感染組在術(shù)后4天和7天分別為6.5049±0.0616 lgCFU VS 6.3216±0.11 lgCFU，(F=52.3，p＜0.05)和6.1527±0.015 lgCFU VS 6.1729±0.013 lgCFU(F=1.1，p＞0.05)。BF感染氨溴索干預(yù)組和BF感染組的血漿抗藻酸鹽抗體含量在兩個時間段分別為0.7721±0.006 VS 1.0005±0.006和0.7917±0.007 VS 1.01

15、95±0.007(F=351.9和844.5，p＜0.05)。BF感染氨溴索干預(yù)組和BF感染組的IL-10水平在術(shù)后4天和7天分別為158.6069±2.009pg/ml VS162.8088±2.166pg/ml和168.4113±0.007pg/ml VS 171.2125±1.578pg/ml，(F=2.1和1.7，p＞0.05。BF感染氨溴索干預(yù)組和BF感染組的IFN-γ水平在在術(shù)后4天和7天分別為74.0397±2.311pg

16、/mlVS126.8600±4.026pg/ml和63.3759±1.516pg/ml VS 174.3221±4.444pg/ml(F=129.5和558.2，p＜0.05)。BF感染氨溴索干預(yù)組和BF感染組的IFN-γ與IL-10比值在術(shù)后4天和7天分別為0.4937±0.011VS0.8088±0.025和0.4566±0.012 VS 1.0264±0.019(F=121.9和731.1，p＜0.05)。 [結(jié)論]氨溴索可破壞大