植物黃酮抗腫瘤效應(yīng)的結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系及ROS相關(guān)作用機(jī)制研究.pdf

1、植物黃酮為一類天然植物多酚化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、谷類等植物性食物中，流行病學(xué)調(diào)查和實驗研究證實，植物黃酮具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等廣泛、優(yōu)良的生物學(xué)效應(yīng)，特別是對于腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、侵襲、血管生成以及耐藥性等各階段、各方面都具有顯著的抑制作用，植物黃酮抗腫瘤活性以其天然、低毒、高效而倍受關(guān)注。 植物黃酮發(fā)揮各種藥理作用的基礎(chǔ)在于其分子結(jié)構(gòu)，不同分子結(jié)構(gòu)的植物黃酮其藥理效應(yīng)可能存在很大差異，而黃酮分

2、子結(jié)構(gòu)中某些特定的取代基或結(jié)構(gòu)特征，對于植物黃酮發(fā)揮某一種特定藥理效應(yīng)可能是必需或極重要的，這些結(jié)構(gòu)元件被稱為關(guān)鍵結(jié)構(gòu).效應(yīng)元件，研究并分析植物黃酮特定分子結(jié)構(gòu)與其特定藥理效應(yīng)之間的構(gòu)效關(guān)系，闡明其中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件，對于揭示植物黃酮特定藥理學(xué)作用的機(jī)制，以及尋找高效的植物藥和合成新藥都具有重要的參考價值。植物黃酮抗腫瘤研究一直為國內(nèi)外一個研究熱點，但絕大多數(shù)研究只側(cè)重于某一種植物黃酮的抗腫瘤效應(yīng)，對不同植物黃酮化合物的抗腫瘤作用的

3、差異研究較少，缺乏相互之間的比較，特別是對于植物黃酮特定分子結(jié)構(gòu)與其抗腫瘤效應(yīng)之間的構(gòu)效關(guān)系缺乏研究，其中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件尚不清楚，因此值得深入探討。 植物黃酮等多酚類化合物作為優(yōu)良的天然抗氧化劑已眾所周知，但事實上植物黃酮可同時具有抗氧化和促氧化兩種相反特性。研究表明，在某些環(huán)境下(如O2大量存在或細(xì)胞過氧化物酶活性較高)，或某些因素誘導(dǎo)下(如過渡金屬Fe或Cu的催化)，植物黃酮可被過氧化物酶氧化生成酚自由基，并形成酚氧化

4、反應(yīng)鏈，這些酚過氧化物可催化谷胱甘肽或輔酶I共氧化并產(chǎn)生活性氧。植物黃酮對疾病的防治作用一般認(rèn)為在于其優(yōu)良的抗氧化及清除自由基特性，然而近期研究發(fā)現(xiàn)，這些植物多酚物質(zhì)在抗腫瘤及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，其促氧化活性可能比其抗氧化活性更加重要，因為ROS可以介導(dǎo)DNA片段化并導(dǎo)致凋亡發(fā)生，很多抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡都與引發(fā)ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)，如抗腫瘤藥物三氧化二砷、順鉑、以及醌類抗癌藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中，胞內(nèi)：ROS的產(chǎn)生都發(fā)揮著

5、重要作用。 正常情況下，細(xì)胞內(nèi)：ROS的產(chǎn)生與消解處于動態(tài)平衡過程中，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境氧化-還原狀態(tài)保持相對穩(wěn)定，而細(xì)胞氧化-還原狀態(tài)對于細(xì)胞的生存及各種功能都是至關(guān)重要的，破壞細(xì)胞氧化-還原狀態(tài)平衡的主要因素是ROS和GSH，現(xiàn)己知道，低微水平的ROS升高可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而較高水平的ROS則引發(fā)細(xì)胞凋亡，更高水平的ROS則直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死。多項研究表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶如SOD和CAT等，其活性都顯著低于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞清除R

6、OS和生成GSH的能力較低，而腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生又往往遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，因此腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在嚴(yán)重的氧化壓力，對ROS十分敏感，ROS對腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷力，近年來，人們已經(jīng)開始開發(fā)利用ROS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤新藥，而某些膳食多酚化合物，其特性例如與DNA結(jié)合、剪切DNA、在過渡金屬存在下產(chǎn)生ROS，都與一些抗腫瘤藥物相似。由此我們推斷，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特別是在細(xì)胞關(guān)鍵部位如細(xì)胞膜、線粒體膜表面及細(xì)胞核內(nèi)引發(fā)ROS，改變細(xì)胞氧化-

7、還原狀態(tài)平衡，對細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵靶點造成氧化壓力，從而啟動細(xì)胞凋亡，這可能是某些植物黃酮抗腫瘤作用的重要機(jī)制。 基于以上分析，本課題應(yīng)用槲皮素等23種分子結(jié)構(gòu)明確、純度單一的常見植物黃酮，作用于白血病HL-60細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、前列腺癌PC3細(xì)胞等6種不同腫瘤細(xì)胞，檢測評價不同植物黃酮對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，分析植物黃酮不同分子結(jié)構(gòu)與其抗腫瘤效應(yīng)間的結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系，以及其中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件；同時篩選出3種抗腫瘤效應(yīng)強(qiáng)的植物

8、黃酮和對植物黃酮作用敏感的白血病HL-60細(xì)胞作為研究對象，運用流式細(xì)胞分析、激光共聚焦掃描顯微鏡、熒光漂白恢復(fù)等先進(jìn)分子生物學(xué)檢測分析技術(shù)，深入研究植物黃酮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中，其胞內(nèi)ROS、GSH和氧化-還原電位的變化，同時對于細(xì)胞中最易受ROS攻擊的細(xì)胞膜和線粒體，本課題進(jìn)一步研究這些植物黃酮對腫瘤細(xì)胞膜流動性和線粒體膜電位的影響，并以抗氧化劑NAC進(jìn)行干預(yù)實驗，探討植物黃酮抗腫瘤的ROS相關(guān)作用機(jī)制。 本研究主要實驗結(jié)

9、果和結(jié)論如下： 1.細(xì)胞增殖狀態(tài)檢測結(jié)果表明，被檢測的23種植物黃酮大部分對腫瘤細(xì)胞增殖都表現(xiàn)出顯著抑制作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢，但不同植物黃酮之間存在較大差異，同時不同腫瘤細(xì)胞對植物黃酮作用表現(xiàn)出不同的敏感性，在被檢測的6種腫瘤細(xì)胞中，白血病HL-60細(xì)胞對于植物黃酮的細(xì)胞毒性作用最敏感，植物黃酮3,6-二羥基黃酮和2’-羥基二氫黃酮對6種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出最強(qiáng)的增殖抑制效應(yīng)，柚皮素和橙皮素對于6種腫瘤細(xì)胞均無顯著增殖抑制作用，

10、而印棉黃素和桑黃素對于多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，以IC50為標(biāo)準(zhǔn)，比較植物黃酮抑制腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)的強(qiáng)弱得出以下順序：3，6-二羥基黃酮＞2’-羥基二氫黃酮＞漆樹黃酮＞3，7-二羥基黃酮＞毛地黃黃酮＞5，7，4’-三羥基黃酮＞槲皮素＞6-羥基黃酮＞7-羥基黃酮＞4’-羥基二氫黃酮＞高良姜黃素＞3’-甲氧基，3，7，4’-三羥基黃酮＞黃芩黃酮＞大豆黃素＞白楊黃素＞楊梅黃酮＞染料木黃酮＞黃酮＞二氫黃酮＞柚皮素＞橙皮素＞桑黃素＞印棉黃素

11、。 2.細(xì)胞增殖檢測結(jié)果表明，在被檢測的23種植物黃酮中3,6-二羥基黃酮表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，進(jìn)一步細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，10μM的3，6-二羥基黃酮處理24h，6種腫瘤細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)均發(fā)生顯著變化，表現(xiàn)為細(xì)胞生長稀疏，排列紊亂，大量細(xì)胞皺縮變圓，胞質(zhì)凝縮，并與其周邊細(xì)胞分離，細(xì)胞貼壁性下降，甚至離開瓶壁漂浮到培養(yǎng)基中，這些形態(tài)變化都是凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞的表現(xiàn)特征；進(jìn)一步DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察可見，正常腫瘤細(xì)

12、胞核呈現(xiàn)彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，出現(xiàn)凋亡形態(tài)(固縮形態(tài)的亮藍(lán)色顆粒)的比率很低，而3,6-二羥基黃酮處理24h后，6種腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)的比率均明顯升高；流式細(xì)胞凋亡分析結(jié)果也表明，10μM的3，6-二羥基黃酮處理24h，6種腫瘤細(xì)胞的凋亡率均顯著升高。這些實驗結(jié)果表明，3，6-二羥基黃酮具有很強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，可有效誘導(dǎo)6種腫瘤細(xì)胞凋亡。 3.植物黃酮抗腫瘤效應(yīng)的結(jié)構(gòu).效應(yīng)關(guān)系分析結(jié)果表明，植物黃酮分子中一定數(shù)目的羥基(2～4個

13、)、C環(huán)2,3位雙鍵、B環(huán)定位于2位、3位羥基、6位羥基、B環(huán)鄰位羥基，對于植物黃酮發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)可能是至關(guān)重要的，是其中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件，相反，羥基數(shù)目的過少或過多、C環(huán)2,3位雙鍵的缺失、B環(huán)定位于3位(異黃酮結(jié)構(gòu))、5位羥基和B環(huán)間位羥基，則會降低植物黃酮分子的抗腫瘤效應(yīng)。 4.細(xì)胞ROS水平和凋亡檢測分析結(jié)果表明，HL-60細(xì)胞ROS水平顯著高于正常人淋巴細(xì)胞，而植物黃酮3，6-dihydroxyflavone、lu

14、teolin和geraldol作用HL-60細(xì)胞，均能引發(fā)ROS，造成ROS水平顯著升高，并有效誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，而hesperetin和naringenin對HL-60細(xì)胞增殖無顯著作用的植物黃酮，對HL-60細(xì)胞ROS水平無顯著影響，且對HL-60細(xì)胞凋亡狀況亦無顯著影響；進(jìn)一步研究表明，3，6-dihydroxyflavone、luteolin和geraldol均能顯著降低HL-60細(xì)胞胞內(nèi)GSH水平，提高GSSG水平，導(dǎo)致

15、HL-60細(xì)胞氧化-還原電位顯著升高；膜流動性和線粒體膜電位檢測結(jié)果表明，3種植物黃酮可顯著降低HL-60細(xì)胞的膜流動性和線粒體膜電位水平。 5.NAC干預(yù)實驗結(jié)果表明，NAC干預(yù)可有效阻斷植物黃酮3，6-dihydroxyflavone、luteolin和geraldol對HL-60細(xì)胞誘發(fā)的ROS水平升高、GSH水平下降和細(xì)胞氧化-還原電位的升高，以及膜流動性和線粒體膜電位的下降，并部分降低3種植物黃酮對HL-60細(xì)胞的增殖

16、抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用。這些實驗結(jié)果表明，引發(fā)ROS和氧化-還原電位水平升高，在3，6-dihydroxyflavone、luteolin和geraldol誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用，通過引發(fā)ROS和細(xì)胞氧化.還原電位水平升高介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是植物黃酮發(fā)揮抗腫瘤作用的一個重要機(jī)制。 綜上所述，本課題通過檢測及比較23種植物黃酮對多種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)3，6-二羥基黃酮具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，結(jié)構(gòu).效應(yīng)關(guān)系

17、分析表明，一定數(shù)目的羥基(2～4個)、C環(huán)2,3位雙鍵、B環(huán)定位于2位、3位羥基、6位羥基、B環(huán)鄰位羥基，是植物黃酮發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)-效應(yīng)元件，同時作用機(jī)制研究表明，植物黃酮3，6-dihydroxyflavone、luteolin和geraldol可顯著提高HL-60細(xì)胞.ROS水平，降低GSH水平，提高細(xì)胞氧化-還原電位，降低細(xì)胞膜流動性和線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明，引發(fā)ROS并提高細(xì)胞氧化-還原電位從而誘導(dǎo)凋亡，是植