超抗原SEB抗腫瘤效應(yīng)研究.pdf

1、作為強大的T細(xì)胞激活劑，SEB在抗腫瘤方面有著潛在的應(yīng)用價值，可以通過超抗原依賴的細(xì)胞毒作用(SDCC)直接對MHCII類陽性的腫瘤細(xì)胞進行殺傷，但是，葡萄球菌腸毒素B可以導(dǎo)致嘔吐腹瀉并引起食物中毒等，這些副作用嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。SEB(H12D/H32D)、SEB(H105D／H121D)、SEB(H12D／H32D／H105D／H121D)、SEB(H32D)、SEB(H32Q)、SEB(H32L)是我們實驗室構(gòu)建的一組葡萄球菌

2、B型腸毒素突變體，本研究中系統(tǒng)地評價了該系列突變體作為抗腫瘤制劑的可能性。首先通過幼貓催吐實驗評價了該系列突變體的致吐活性，發(fā)現(xiàn)在高達5-10倍致吐劑量的攻擊下，SEB(H105D／m21D)與SEB(H32Q)組5只貓中有4只沒有出現(xiàn)嘔吐反應(yīng)，而對照組wt—SEB組全部出現(xiàn)嘔吐反應(yīng)，這兩個突變體不僅與wt-SEB具有類似的MHCII類分子結(jié)合活性，而且在針對SMMC-7721與船兩種不同來源的腫瘤細(xì)胞的體外抑瘤活性實驗中均具有良好的腫

3、瘤細(xì)胞生長抑制能力，SEB(H32Q)對SMMC7721的半數(shù)抑制濃度僅為0．798ng／mL，在建立的C57BL／6Lewis肺癌模型中，腹腔給予125pg／kg的SEB(H32Q)可明顯抑制小鼠的腫瘤生長，與生理鹽水對照組相比具有顯著性差異(P<0．05)，且治療組與對照組相比，出現(xiàn)了明顯的腫瘤壞死和淋巴細(xì)胞浸潤。第一次證實了SEB(H32Q)作為腫瘤免疫治療制劑的可行性，體內(nèi)外實驗均證明該突變體分子具有較高的腫瘤抑制活性。

4、 SDCC具有MHC—II限制性，只能裂解表達MHC．II類抗原的靶細(xì)胞。但許多腫瘤細(xì)胞MHC-II類分子表達水平低下或缺失，使超抗原對腫瘤細(xì)胞的殺傷不能借助SDCC作用，治療效果令人失望?？鼓[瘤特異性抗體與超抗原偶聯(lián)形成的靶向超抗原可以通過超抗原抗體依賴的細(xì)胞毒作用(SADCC作用)克服這一缺點，從而有效的裂解腫瘤細(xì)胞。因此我們制備了以連接肽GGGSGGS連接抗肝癌基因工程抗體scFv25和SEB的融合蛋白(scFv-SEB)并對其體

5、外抗腫瘤活性進行了系統(tǒng)評價。首先采用生物信息學(xué)軟件對融合蛋白scFv-SEB分子的可及性與柔性，抗原性與疏水性以及二級結(jié)構(gòu)等進行了預(yù)測與分析，結(jié)果顯示，融合后對scFv及SEB具有各自的空間結(jié)構(gòu)，連接肽具有低抗原性和高結(jié)合活性，因而不影響融合蛋白的二級結(jié)構(gòu)，可以在最大程度上保持各自的生物學(xué)活性；然后采用新型雙順反子表達載體pTIG-trx對重組蛋白進行了高效可溶性表達，比傳統(tǒng)的pET系列載體較大程度的提高了可溶性，并可省去常規(guī)載體需要表

6、達后酶切去掉trx蛋白的步驟。純化后的scFv-SEB蛋白進行了系列實驗測定其生物學(xué)活性。細(xì)胞ELISA與細(xì)胞免疫化學(xué)檢測重組蛋白與肝癌細(xì)胞的結(jié)合活性，與正常肝細(xì)胞系HL02相比較，融合蛋白對肝癌細(xì)胞具有更高的親合力和特異性，MTS法檢測該融合蛋白的體外抗腫瘤活性表明，scFv-SEB可以有效的激活T細(xì)胞裂解人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，而且具有明顯的劑量一效應(yīng)關(guān)系，其抑制能力與單純使用SEB相當(dāng)；利用抗HLA-DR抗體進行抗體封閉實驗

7、表明，融合蛋白裂解腫瘤細(xì)胞的機理不僅包括超抗原依賴的細(xì)胞毒性作用(SDCC作用)，而且還包括超抗原抗體依賴性細(xì)胞毒性作用(SADCC)。所有的這些結(jié)果都表明該融合蛋白是一個很有希望的腫瘤免疫治療劑。 在現(xiàn)有的幾種導(dǎo)向載體中，單鏈抗體(scFv)有較成熟的原核表達系統(tǒng)，分子量小，產(chǎn)量較高，但是穩(wěn)定性較差，因此，在構(gòu)建了scFv-SEB的基礎(chǔ)上，對mscFv進行改造，構(gòu)建dsFv靶向超抗原SEB。在VH氨基酸的第44位，第105位與

8、VL氨基酸的第43位，100位處通過突變引入半胱氨酸，分別命名為VH44、VHl05、VL43和VL1.00，通過PCR法融合形成VL43．SEB、VH44-SEB，VHl05、VLl00、VH43一SEB、VH44-SEB的重組表達菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在大腸桿菌BL21(DE3)plys中以包涵體形式表達，分子量分別大約為12kD，12kD，42kD，42kD，表達量占菌體蛋白的25-30％以上，包涵體洗滌、變性后，分別將VHl05與

9、VH43．SEB、VL1.00與VH43．SEB等比例混合在氧化條件下的復(fù)性液中復(fù)性，最終形成兩個約54kD的融合蛋白，即VHl05-VL43．SEB和VH44-SEB-VLl00兩個dsFv-SEB分子。這兩個融合蛋白在進行還原條件下的SDS-PAGE分析時，都可以解離為兩個分別為12kD、42kD的分子，證明分子間二硫鍵已經(jīng)形成；VHl05-VL43．SEB在細(xì)胞ELISA法檢測融合分子對SMMC-7721的結(jié)合實驗中表現(xiàn)出較好的結(jié)