高效拮抗水稻白葉枯病菌植物內(nèi)生真菌的選育和防效研究.pdf

1、水稻白葉枯病是我國(guó)水稻生產(chǎn)中的四大病害之一，主要是由水稻黃單胞桿菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)通過(guò)水稻葉片的水孔和傷口侵入并于維管束內(nèi)大量繁殖和擴(kuò)展而引起的一種細(xì)菌性病害。當(dāng)前主要通過(guò)施加化學(xué)農(nóng)藥如葉枯唑、殺枯凈等藥劑或選育抗性水稻品種的方法。但大量施加化學(xué)農(nóng)藥易造成農(nóng)藥殘留，生態(tài)環(huán)境破壞、有益生物被殺等問(wèn)題。
　　植物內(nèi)生真菌是指寄生在健康植物莖葉中，但對(duì)寄主又形成不明顯侵染的一類真菌，其

2、普遍存在于現(xiàn)階段已研究過(guò)的水生植物和陸生植物體內(nèi)。相對(duì)植物體內(nèi)生物總量而言，內(nèi)生真菌所占比例雖然微乎其微，但是其在整個(gè)農(nóng)業(yè)發(fā)展過(guò)程中卻發(fā)揮著舉足輕重的作用。除了已被普遍認(rèn)可的增強(qiáng)植物抗逆性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等作用外，內(nèi)生真菌還能產(chǎn)生異香豆類、生物堿類、殺蟲類、醌類、肽類、酚類等抗菌活性成分物質(zhì)。而這些抗菌活性物質(zhì)能特異性地抑制某些病原菌的生長(zhǎng)和繁殖速度，從而達(dá)到降低農(nóng)作物病害的目的。因此，現(xiàn)階段從自然環(huán)境中選育一株對(duì)水稻白葉枯病菌具有高效拮

3、抗作用的植物內(nèi)生真菌是防治白葉枯病菌病害的一個(gè)重要方向。
　　第一，本實(shí)驗(yàn)室從浙江省金華市郊水稻田健康水稻葉片內(nèi)分離獲得一株高效拮抗水稻白葉枯病菌的植物內(nèi)生真菌Bo-1菌株。經(jīng)形態(tài)特征、ITS rDNA序列分析與比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，Bo-1菌株被鑒定為淡色生赤殼菌（Bionectriaochroleuca）。生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，Bo-1菌株對(duì)碳源、氮源的利用沒(méi)有表現(xiàn)出特別的選擇性，并且可以水解明膠、淀粉、尿素、酪蛋白等大分子物

4、質(zhì);對(duì)外界環(huán)境的耐受能力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Bo-1菌株對(duì)酸性和弱堿性環(huán)境以及高、低溫環(huán)境都具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。
　　第二，選取多種病原菌作為供試菌，測(cè)定淡色生赤殼菌（Bionectriaochroleuca）Bo-1菌株的抗菌譜。結(jié)果表明:Bo-1菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對(duì)多種細(xì)菌類病原體都具有較強(qiáng)拮抗能力，其中對(duì)白色念珠菌（Moniliaalbican，M..albican）拮抗力最大，抑菌圈直徑達(dá)38.9mm。以Xoo作為指示菌，測(cè)定

5、淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株乙酸乙酯提取物抑菌穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明，Bo-1菌株的乙酸乙酯提取物抑菌活性隨著溫度的升高而降低，121℃時(shí)抑菌圈直徑降至17.6 mm;隨著酸堿性增強(qiáng)，抑菌活性均呈逐步下降趨勢(shì)，但在pH2.5和pH10.5下依然保持較高抑菌活性;對(duì)于紫外光40 W或普通光源4000 lx光照處理，其保持了穩(wěn)定的抑菌能力。
　　第三，采用單因素試驗(yàn)測(cè)定Bo-1菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)培養(yǎng)所

6、需的最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)其培養(yǎng)基配方和搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明，Bo-1菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)最佳碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽分別為淀粉、蛋白胨、MgSO47H2 O;最佳培養(yǎng)基配方:淀粉30 g/L，蛋白胨2g/L，MgSO47H2O0.5g/L;最佳發(fā)酵條件為:溫度30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，裝液量80 mL/250 mL，pH6.5。
　　第四，盆栽試驗(yàn)，測(cè)定淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca

7、）Bo-1菌株乙酸乙酯提取物水溶液對(duì)水稻白葉枯病的生防效果。采用人工剪葉法侵染4種感病水稻品種，并分別用方法1（先噴藥后接種P6菌）、方法2（先接種P6菌后噴藥）、方法3（只接種P6菌）、無(wú)菌水空白對(duì)照組共4種不同方法處理水稻葉片。試驗(yàn)結(jié)果表明，水稻葉片病斑抑制率最高達(dá)到86.38％，病情指數(shù)最大下降了41.62％，防效作用最大達(dá)59.67％。此外，比對(duì)試驗(yàn)中所采用的3種方法不難發(fā)現(xiàn)，方法1的防治效果明顯優(yōu)于其他兩種方法，而方法1主要側(cè)

8、重于預(yù)防。由上可知，在防治水稻白葉枯病過(guò)程中，采取預(yù)防手段更為重要。
　　第五，以Xoo P6生理小種作為指示菌進(jìn)行活性跟蹤，通過(guò)分步萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜等步驟，分離純化獲得拮抗活性物質(zhì)結(jié)晶，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行核磁共振氫譜分析和質(zhì)譜分析，通過(guò)解析與比對(duì)，該物質(zhì)分子量為344.0835，分子式為C18H16O7，鑒定為松蘿酸(usnic acid)。將純化的松蘿酸以3％中生菌素和20％葉枯唑?yàn)閷?duì)照，采用96孔板法測(cè)定對(duì)Xoo P