睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子CNTF基因重組腺病毒的包裝.pdf

1、目的：周圍神經(jīng)損傷是臨床上常見疾病，周圍神經(jīng)損傷的顯微外科修復(fù)技術(shù)已經(jīng)十分精湛，卻長期以來難以獲得滿意結(jié)果。隨著分子生物學(xué)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)不斷進(jìn)步，神經(jīng)損傷的基因治療研究正在興起。
　　 應(yīng)用復(fù)制缺陷型重組腺病毒（Adenovirus，AdV）為載體將各種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)入脊髓以保護(hù)受損的神經(jīng)元和促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的研究，已成為神經(jīng)修復(fù)研究領(lǐng)域的前沿課題。有關(guān)腺病毒的研究和開發(fā)進(jìn)展很快，并已成功應(yīng)用于多項基因治療臨床試驗中。腺病毒

2、載體具有感染效率高、宿主范圍廣、能感染分裂期或靜息期細(xì)胞、基因裝載容量大、易制備高滴度病毒、不插入宿主基因組、遺傳毒性較低等優(yōu)點(diǎn)。CNTF是由200個氨基酸組成的酸性蛋白，與NTF家族沒有同源性，被稱為非靶源性營養(yǎng)因子。
　　 CNTF在神經(jīng)再生過程中起著重要的營養(yǎng)支持作用，其作用能支持感覺、交感及運(yùn)動神經(jīng)元存活和分化，防止軸突切斷后運(yùn)動神經(jīng)元的凋亡以及神經(jīng)細(xì)胞在發(fā)育過程中的程序性死亡。它還是第一個被發(fā)現(xiàn)的能促進(jìn)離體和在體運(yùn)動神

3、經(jīng)元存活，防止神經(jīng)退變的神經(jīng)因子。CNTF和其受體在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，具有廣泛的生物學(xué)活性，可以提高體內(nèi)外各種類型外周神經(jīng)元的存活。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)、髓鞘和睫狀神經(jīng)節(jié)的雪旺氏細(xì)胞（SC），CNTF呈高水平表達(dá)，主要位于細(xì)胞體和突起，而核中無陽性反應(yīng)。CNTF主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞；作用模式是逆向傳遞機(jī)制，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）的生物功能多樣，能促進(jìn)運(yùn)動神經(jīng)元群細(xì)胞存活，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化都具有明顯的營

4、養(yǎng)作用。利用分子生物技術(shù)克隆大鼠睫狀神經(jīng)生長因子（CNTF）基因片段構(gòu)建腺病毒載體，制備病毒顆粒從而進(jìn)一步為研究腺病毒載體介導(dǎo)的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在周圍神經(jīng)損傷中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.利用實(shí)驗室保存的普通感受態(tài)制作超級感受態(tài)。從感受態(tài)大腸桿菌菌種中抽吸菌液培養(yǎng)過夜轉(zhuǎn)接于200mlLB培養(yǎng)基中，在OD600值在0.4左右時收獲細(xì)菌。加入100ul預(yù)冷0.1M CaCL2溶液，冷凍離心用移液槍輕輕上下吸動

5、打勻，使細(xì)胞重新懸浮，動作輕柔。細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化試驗或加入15％-30％的甘油后-80℃保存待用。（具體見實(shí)驗步驟）
　　 2.利用公司已經(jīng)包裝的含有CNTF的腺病毒載體的質(zhì)粒在超級感受態(tài)中轉(zhuǎn)化從而擴(kuò)增得到能夠轉(zhuǎn)染計量的質(zhì)粒。在感受態(tài)中加入質(zhì)粒5ul冰上解凍，熱擊后冰上冷卻，加入培養(yǎng)基后震蕩培養(yǎng)1小時，在篩選平板上鋪板培養(yǎng)16-24小時，長出單克隆菌群后挑菌培養(yǎng)，離心后按質(zhì)粒提取試劑盒步驟提取質(zhì)粒。
　　 3.擴(kuò)

6、增后得到的質(zhì)粒使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染人腎胚293細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，包裝帶有CNTF基因的重組腺病毒，在-70℃和37℃溫度下通過反復(fù)凍融制備高滴度腺病毒。
　　 4.病毒擴(kuò)增后在96孔板中感染培養(yǎng)好的人腎胚293細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到293細(xì)胞有明顯的CPE現(xiàn)象，利用50％組織培養(yǎng)感染劑量法測定病毒滴度。
　　 結(jié)果：
　　 1.將擴(kuò)增質(zhì)粒按照實(shí)驗步驟的體系配好，制膠測定篩選擴(kuò)增質(zhì)粒與公司合成質(zhì)粒酶切結(jié)

7、果相同。
　　 2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的293細(xì)胞在培養(yǎng)24小時后即可在倒置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，即檢測到報告基因CNTF的表達(dá)，細(xì)胞表達(dá)出攜帶目的基因的腺病毒顆粒，對照組未發(fā)現(xiàn)熒光表達(dá)。轉(zhuǎn)染成功。
　　 3.在96孔板上培養(yǎng)293細(xì)胞，用獲得病毒感染293細(xì)胞后計數(shù)出現(xiàn)CPE孔個數(shù)，測定病毒滴度。最后獲得病毒滴度為2.5×107TCID50/ml。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用可靠的方法成功的