深圳地區(qū)銅綠假單胞菌臨床分離株的耐藥現(xiàn)狀及分子耐藥機(jī)制研究.pdf

1、[目的]
　　 銅綠假單胞菌是臨床最常見的條件致病菌之一,可感染人體各個組織和器官,對一些自身免疫缺陷的患者?？梢鹄^發(fā)性機(jī)會感染,而多重耐藥銅綠假單胞菌的出現(xiàn)給臨床抗感染治療帶來極大的困擾。銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制非常復(fù)雜,常是多基因多因素共同作用的結(jié)果,為了解深圳地區(qū)銅綠假單胞菌的耐藥現(xiàn)狀及主要的耐藥機(jī)制,掌握耐藥基因的種類及其與耐藥性的關(guān)系,分析耐藥表型及耐藥基因之間的相關(guān)性,并分析銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類的主要機(jī)理,為臨床治

2、療銅綠假單胞菌感染的合理應(yīng)用抗生素及流行病學(xué)研究提供依據(jù)和指導(dǎo)
　　 [方法]
　　 (1)收集深圳市第四人民醫(yī)院2005年8月～2007年9月的銅綠假單胞菌臨床分離株119例;對碳青霉烯類抗生素(亞胺培南和美洛培南)表現(xiàn)不敏感的銅綠假單胞菌29株;
　　 (2)采用法國梅里埃細(xì)菌鑒定儀ATB PSE5試條測定這119株銅綠假單胞菌的藥敏表型;
　　 (3)采用E-test法檢測29例對碳青霉烯類抗生素表

3、現(xiàn)不敏感的銅綠假單胞菌對哌拉西林、頭孢他啶、亞胺培南、美洛培南、慶大霉素、妥布霉素及環(huán)丙沙星7種抗生素的最小抑菌濃度;
　　 (4)應(yīng)用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取銅綠假單胞菌總DNA;
　　 (5)以菌株DNA為模版,應(yīng)用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增CTX-M、TEM、SHV、OXA、DHA-1、AmpC、GES-2、IMP-1、VIM-1、VIM-2、SPM、IntI、OprD、PER-1、VEB-1、CA

4、RB、KPC17個耐藥基因;
　　 (6)應(yīng)用貝克曼CEQ8800測序儀對部分陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序,并進(jìn)行檢索及基因分型;
　　 (7)采用三維實(shí)驗(yàn)對AmpC及KPC酶進(jìn)行表型測定;
　　 (8)采用亞胺培南和美洛培南-EDTA雙紙片增效法檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶表型;
　　 (9)質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的轉(zhuǎn)移。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)119株銅綠假單胞菌在各

5、臨床標(biāo)本中的分布分別為痰標(biāo)本105例,占88.24％,呼吸道的分離率為88.24%,尿液標(biāo)本6例,占5.04%,糞便標(biāo)本2例,占1.68%,分泌物標(biāo)本4例,占3.36%,其他2例,占1.68%。感染人群以40歲以上年齡段為主,占84.87%(101/119),科室分布以呼吸內(nèi)科檢出率最高,占24.37%,其次是腦(神經(jīng))外科(18.49%)和心血管內(nèi)科(16.81%),ICU為13.45%,其他科室如普內(nèi)、普外、綜合檢出占26.88%。

6、
　　 (2)銅綠假單胞菌對15種抗生素的藥敏結(jié)果顯示:對替卡西林、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林、妥布霉素、環(huán)丙沙星、頭孢他啶耐藥率均大于30%;耐藥率最高為慶大霉素(53.78%)和頭孢吡肟(44.54%);對亞胺培南和美洛培南耐藥率為24.37%和23.53%;阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦的敏感率較高,為78.15%和72.27%;對多粘菌素E最敏感(96.64%),其中,有31例菌株表現(xiàn)為多重耐藥,即對哌拉西林、環(huán)丙沙星/

7、左氧氟沙星、亞胺培南和一種三代頭孢菌素三種或以上藥物耐藥的菌株,占26.1%。
　　 (3)銅綠假單胞菌17種耐藥基因PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果顯示:TEM陽性103株,占86.6%,SHV陽性2株,占1.7%,CARB-2(PSE-1)陽性菌株14例,占11.8%,OXA陽性菌株2例,占1.7%,DHA-1陽性菌株3例,占2.5%,AmpC陽性菌株77例,占64.7%,VIM-2陽性菌株19例,占16.O%,Ⅰ型整合子檢出60例,占

8、50.4%,OprD檢出75例,占63.0%,外膜蛋白缺失率為37.0%,其余基因均陰性。本研究尚發(fā)現(xiàn)多耐藥基因攜帶狀況嚴(yán)重,經(jīng)統(tǒng)計(jì)有78株銅綠假單胞菌同時攜帶有2個或以上的耐藥基因,占65.5%。
　　 (4)E-test法對29例耐碳青霉烯銅綠假單胞菌7種抗生素的最小抑菌濃度的檢測,結(jié)果表明這29例銅綠假單胞菌均為多重耐藥菌株,其中,這些菌株對亞胺培南、美洛培南及慶大霉素耐藥率最高,均為89.7%,哌拉西林居第二位,耐藥率為

9、75.9%,以下依次是妥布霉素、環(huán)丙沙星及頭孢他啶,耐藥率分別為72.4%、69.0%和44.9%。
　　 (5)三維實(shí)驗(yàn)及EDTA-亞胺培南和美洛培南雙紙片增效實(shí)驗(yàn)結(jié)果:頭孢西丁三維實(shí)驗(yàn)對AmpC酶表型進(jìn)行確證,結(jié)果顯示有5例出現(xiàn)矢狀生長菌苔,這說明這5例銅綠假單胞菌是AmpC酶持續(xù)高產(chǎn)型菌株。利用亞胺培南和美洛培南雙紙片擴(kuò)散法對金屬酶表型進(jìn)行確證,結(jié)果表明有18例為金屬酶確證實(shí)驗(yàn)陽性的菌株,其中有15例與VIM一2基因型檢測

10、一致,3例確證實(shí)驗(yàn)陽性但VIM-2基因型陰性,尚有1例VIM-2基因型陽性但確證實(shí)驗(yàn)陰性。KPC酶確證實(shí)驗(yàn)與KPC基因型檢測一致,均陰性。
　　 (6)1例攜帶有VIM-2型金屬β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的銅綠假單胞菌質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)陽性。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)銅綠假單胞菌引起的感染以呼吸道多見,其致病性和耐藥率有隨年齡增長而增加的趨勢。
　　 (2)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示深圳市第四人民醫(yī)院銅綠假單胞菌耐藥現(xiàn)狀堪

11、憂,多重耐藥嚴(yán)重。
　　 (3)銅綠假單胞菌多重耐藥及碳青霉烯耐藥機(jī)制均是多基因多因素共同作用的結(jié)果。
　　 (4)深圳地區(qū)存在VIM-2型金屬β-內(nèi)酰胺酶,且具有一定的質(zhì)粒傳播性。
　　 (5)產(chǎn)生金屬β-內(nèi)酰胺酶是銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。
　　 (6)CARB-2(PSE-1)型β-內(nèi)酰胺酶對替卡西林和哌拉西林能產(chǎn)生很高的耐藥性。
　　 (7)EDTA-亞胺培南和美洛培南