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文檔簡介
1、本文從以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討:
第一部分 槐耳抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡
目的:觀察槐耳對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響,并檢測相關(guān)標(biāo)志蛋白,明確槐耳誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的具體途徑。
方法:MTT及單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測槐耳對肝癌細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞凋亡及周期分布,Hoechst33258染色觀測肝癌細(xì)胞凋亡小體,應(yīng)用全凋亡抑制劑Z-VAD-FMK觀察肝癌細(xì)胞凋亡變化,驗(yàn)證槐耳誘導(dǎo)凋亡。Wester
2、n blot檢測周期及凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1、Caspase3/8/9、PARP、Survivin、p53、Bcl-2家族蛋白,明確槐耳誘導(dǎo)凋亡的具體途徑。
結(jié)果:槐耳明顯抑制HepG2、Huh7增殖,并呈時(shí)間、濃度依賴性,藥物作用時(shí)間延長,濃度增加,細(xì)胞存活率隨之降低。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示隨著槐耳濃度的增加,細(xì)胞增殖周期阻滯效果越明顯,周期分布呈現(xiàn)濃度依賴性。周期相關(guān)蛋白Cyclin D1及CDK2在槐耳作用后表達(dá)
3、顯著下降。
在HepG2及Huh7細(xì)胞中,槐耳處理細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率顯著上升,明顯高于對照組,相應(yīng)的PARP、Caspase3、8、9出現(xiàn)裂解,表達(dá)量顯著增加。Bcl-2家族蛋白中Bcl-2、Bcl-xL及Mcl-1表達(dá)均顯著降低,而Bim、Bax表達(dá)均顯著升高,同時(shí)抑癌蛋白P53表達(dá)顯著升高。Survivin在兩種細(xì)胞中表達(dá)均顯著下降。在應(yīng)用Z-VAD-FMK后,槐耳對肝癌細(xì)胞增殖的抑制顯著減弱,細(xì)胞增殖能力顯著回升,凋亡水平
4、顯著下降。而相應(yīng)的槐耳聯(lián)合Z-VAD-FMK作用后Caspase3及PARP蛋白表達(dá)量較槐耳組顯著下降。
結(jié)論:槐耳能夠阻滯肝癌細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期,并抑制Cyclin D1的表達(dá),與此同時(shí)還能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,并使Bcl-2家族抑凋亡蛋白表達(dá)降低,促凋亡蛋白表達(dá)升高?;倍€能使Survivin表達(dá)降低,并提高了p53的表達(dá)?;倍赡苁峭ㄟ^同時(shí)激活內(nèi)外源凋亡途徑來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。
第二部分 p38MAPK
5、信號(hào)通路調(diào)控槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡
目的:槐耳誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控機(jī)制。
方法:Western blot檢測MAPK信號(hào)通路變化;應(yīng)用MAPK信號(hào)通路抑制劑后,通過MTT及流式細(xì)胞術(shù)觀察其對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響,Western blot檢測凋亡標(biāo)志性蛋白改變,明確主要調(diào)控通路;同時(shí)檢測Bcl-2家族蛋白、Survivin在MAPK抑制劑作用下表達(dá)的改變。
結(jié)果:槐耳作用于HepG2及Huh7細(xì)胞后
6、,MAPK三條主要途徑均活化。ERK及JNK在兩種細(xì)胞中4小時(shí)內(nèi)即顯著活化,但隨槐耳作用時(shí)間延長JNK及ERK表達(dá)逐漸下降;p38 MAPK在兩種細(xì)胞中活化最為顯著。
p38MAPK抑制劑顯著減弱槐耳對肝癌細(xì)胞的抑制作用。在HepG2及Huh7細(xì)胞中,p38MAPK抑制劑可以使肝癌細(xì)胞凋亡率顯著下降,JNK及ERK抑制劑則對肝癌細(xì)胞凋亡影響較小。MTT及克隆形成結(jié)果顯示p38MAPK抑制劑能夠顯著提高肝癌細(xì)胞的增殖能力,而ER
7、K及JNK抑制劑則未能產(chǎn)生顯著影響。相應(yīng)的p38 MAPK抑制劑作用后Cleaved Caspase3及PARP表達(dá)顯著下降,JNK抑制劑作用后蛋白表達(dá)無顯著變化,ERK抑制劑作用后Cleaved Caspase3及PARP表達(dá)均顯著上升。
p38MAPK抑制劑顯著影響B(tài)cl-2家族蛋白及Survivin表達(dá)。在HepG2及Huh7細(xì)胞中,加入p38MAPK抑制劑后,Bcl-2及Survivin表達(dá)顯著回升,而Bax則顯著下降
8、;JNK抑制劑作用后Bcl-2、Survivin表達(dá)均提高,但Bax表達(dá)變化不同;ERK抑制劑作用后Bax表達(dá)上升,而Bcl-2及Survivin表達(dá)則下降。
結(jié)論:MAPK三條途徑在槐耳作用后均活化,其中p38MAPK最為顯著?;倍T導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡可能是主要通過p38MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)Survivin及Bcl-2家族蛋白來實(shí)現(xiàn)的。Survivin能夠減弱槐耳對肝癌細(xì)胞的抑制效果,聯(lián)合p38MAPK抑制劑后能夠進(jìn)一步減弱槐耳
9、的抗癌作用。Survivin可能是p38MAPK潛在的靶蛋白。
第三部分 p38MAPK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡及自噬
目的:觀察槐耳能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬,明確自噬對肝癌細(xì)胞凋亡的影響,研究MAPK信號(hào)通路對肝癌細(xì)胞自噬的影響及其調(diào)控機(jī)制。
方法: Western blot檢測自噬標(biāo)志性蛋白及AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白,電鏡觀察自噬體形成;應(yīng)用自噬抑制劑及誘導(dǎo)劑后MTT及流式細(xì)胞術(shù)觀察自
10、噬對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響;MAPK抑制劑作用后觀察肝癌細(xì)胞自噬變化,明確調(diào)控機(jī)制。
結(jié)果:槐耳能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬,并抑制AKT/mTOR信號(hào)通路。p62表達(dá)量隨著槐耳作用時(shí)間的延長顯著下降,Beclin1表達(dá)量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值則顯著提高。而自噬上游相關(guān)蛋白AKT、mTOR及p70S6K在HepG2及Huh7中表達(dá)均顯著下降。
自噬顯著影響肝癌細(xì)胞的凋亡。在HepG2及Huh7細(xì)胞中,Rapamyci
11、n可以顯著降低槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡率;而應(yīng)用CQ則使細(xì)胞凋亡略升高,但與槐耳組相比凋亡率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MTT檢測顯示Rapamycin處理肝癌細(xì)胞后,細(xì)胞增殖能力較槐耳組顯著提高,而CQ作用后,細(xì)胞增殖率顯著下降。HepG2及Huh7細(xì)胞在Rapamycin處理后,Cleaved Caspase3表達(dá)較槐耳組明顯減少,而PARP在Rapamycin作用下有所減少;CQ作用后,Cleaved Caspase3表達(dá)水平顯著提高,而PA
12、RP表達(dá)量較槐耳組無顯著差異。
p38 MAPK及JNK參與調(diào)節(jié)槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬。在HepG2及Huh7細(xì)胞中,與對照組相比,p38MAPK抑制劑作用后,細(xì)胞自噬顯著增強(qiáng),Beclin1表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著提高,而p62表達(dá)顯著下降;JNK抑制劑則使Beclin1表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降,p62表達(dá)升高;ERK抑制劑則對肝癌細(xì)胞自噬水平無顯著影響,Beclin1、p62及LC3表達(dá)均未發(fā)生顯著改變。免
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