不同Synaptotagmin在調(diào)節(jié)LβT2細(xì)胞分泌中的功能研究.pdf

1、Synaptotagmin (Syt) 是一個廣泛存在于神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)的分泌囊泡上的蛋白質(zhì)家族。作為鈣離子依賴性神經(jīng)遞質(zhì)和激素釋放過程中的鈣離子感受器，Syt觸發(fā)和調(diào)節(jié)囊泡與靶膜的融合過程，參與對神經(jīng)遞質(zhì)和激素釋放過程的嚴(yán)格調(diào)控，也可能參與對細(xì)胞的蛋白質(zhì)與膜轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)。該家族在哺乳動物中有16種以上的亞型，它們在細(xì)胞內(nèi)有各自不同的定位，并發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能。通過亞型間以及亞型和效應(yīng)物分子間的相互作用，特別是對鈣離子的結(jié)合，Syt對胞

2、吐過程進(jìn)行著有效地調(diào)控。在膜融合的事件中，大部分是需要鈣離子的存在的。Syt可能是一種在較為寬廣范圍的膜融合事件中廣泛分布的鈣離子敏感的融合機制中的調(diào)控蛋白。 本課題以一種鼠源性傳代促性腺激素釋放細(xì)胞系LβT2細(xì)胞為研究對象深入研究Syt在細(xì)胞分泌中的分子調(diào)控機制。垂體促性腺激素釋放細(xì)胞分泌促性腺激素，在生殖系統(tǒng)中起到中心調(diào)節(jié)的作用，其分泌活動的異常會直接影響到生長發(fā)育和性功能成熟等。對分泌的機制以及它的調(diào)控機制的研究，對于進(jìn)一

3、步正確認(rèn)識分泌現(xiàn)象的本質(zhì)，對于那些與分泌有關(guān)的疾病的治療及相關(guān)藥物的開發(fā)都有著重要的現(xiàn)實意義。 Syt家族是多亞型的蛋白家族，因此需要應(yīng)用一種高效篩選方法，研究每種Syt在細(xì)胞分泌中的分子調(diào)控機制。本實驗應(yīng)用RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 技術(shù)，在RNA的轉(zhuǎn)錄后階段將Syt基因的表達(dá)進(jìn)行沉默，形成knockdown的效果，并在此基礎(chǔ)上對沉默的Syt基因進(jìn)行功能變化的檢測。實驗使用短暫 (～1.5 ms

4、) 強紫外光裂解光敏感的Ca2+螯合物NP-EGTA，使胞漿內(nèi)的鈣離子濃度 [Ca2+]I 快速 (<2ms) 升高到～20微摩爾，刺激細(xì)胞分泌，并同時測量膜電容和鈣離子濃度。在本研究課題中，我們將Syt IV和Syt VII分別與EGFP (Enhanced green fluorescent protein，增強綠色熒光蛋白) 融合，構(gòu)建了pEGFP-N1-Syt IV和pEGFP-N1-Syt VII表達(dá)載體。采用全內(nèi)反射成像技術(shù)

5、，詳細(xì)地研究各種Syt亞型的細(xì)胞內(nèi)定位。 實驗結(jié)果表明 (1)通過選擇合適的目標(biāo)序列，經(jīng)shRNA沉默的細(xì)胞中Syt I、IV、VII、IX的表達(dá)量為野生型細(xì)胞表達(dá)量的27％、36％、32％和25％。 (2)Syt I蛋白表達(dá)沉默對分泌的快速簇發(fā)相 (Fast burst)，慢速簇發(fā)相 (Slow burst) 和持續(xù)相 (Sustained) 的大小都沒有顯著影響；Syt VII蛋白表達(dá)沉默對分泌的快速簇發(fā)相和

6、持續(xù)相的幅度都沒有顯著影響，但選擇性地減少了慢速簇發(fā)相的幅度；Syt IX蛋白表達(dá)沉默顯著性地減少快速簇發(fā)相和持續(xù)相，但對慢速簇發(fā)相沒有顯著的影響。 (3)Syt IX (本實驗室已有質(zhì)粒) 標(biāo)記的囊泡與用NPY-DsRed標(biāo)記的致密核心大囊泡共存，Syt VII標(biāo)記的囊泡與用CD63-TDimer2標(biāo)記的溶酶體共存。 從以上實驗結(jié)果，我們推測分泌的快速簇發(fā)相和慢速簇發(fā)相可能由不同的Syt介導(dǎo)；由于Syt VII定位于溶