氧化苦參堿調(diào)控MAPK信號保護TGF-β1誘導心肌細胞損傷的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本課題以體外培養(yǎng)的SD新生乳鼠心肌細胞為研究對象,采用TGF-β1復(fù)制心肌細胞損傷模型,研究 TGF-β1在介導心肌細胞損傷過程中對MAPK信號通路的影響,進一步研究氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)對TGF-β1誘導心肌細胞損傷的保護作用,探討OMT對心肌細胞損傷的保護機制,為OMT預(yù)防和治療心血管疾病提供一定的實驗基礎(chǔ)。
  第一部分 TGF-β1誘導心肌細胞損傷與MAPK信號通路的相關(guān)性
  目的:探討TGF-

2、β1誘導的新生SD大鼠原代心肌細胞損傷病理過程中絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)家族P38、c-Jun氨基端激酶(JNK)和ERK1/2信號的作用。
  方法:采用胰酶消化法、差速貼壁法及化學抑制劑法分離、純化1-3 d新生SD大鼠心肌細胞進行原代培養(yǎng);倒置顯微鏡觀察正常細胞在48 h、72 h的形態(tài)學改變;免疫細胞化學法分析心肌細胞特異性肌動蛋白(ɑ-Sarcom

3、eric-actin,α-actin)、肌鈣蛋白(Cardiac Troponin T,c-TnT),鑒定心肌細胞及其純度。采用MTT法觀察不同濃度的TGF-β1對心肌細胞影響,根據(jù)相關(guān)文獻,TGF-β1濃度分別設(shè)定為1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL,研究TGF-β1誘導心肌細胞損傷的量毒關(guān)系,最終確定TGF-β120 ng/ml、作用時間48 h作為心肌細胞損傷模型復(fù)制條件;

4、實驗共分為9組:正常對照組(Ctrl),TGF-β1,TGF-β1 inhibitor(I)組,TGF-β1+P38 I組,TGF-β1+JNK I組,TGF-β1+ERK1/2 I,TGF-β1+TGF-β1 I+P38 I組,TGF-β1+TGF-β1 I+JNK I組,TGF-β1+TGF-β1 I+ERK1/2 I組;MTT法檢測細胞的存活率,LDH外漏分析細胞膜損傷程度,Giemsa染色法從形態(tài)學上觀察各組心肌細胞形態(tài)學的變化

5、,Western blot檢測各組p-P38、p-JNK、p-ERK1/2、t-P38、t-JNK及t-ERK1/2蛋白表達水平。
  結(jié)果:倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)心肌細胞貼壁后呈多邊形,48 h后細胞開始出現(xiàn)偽足,并且出現(xiàn)搏動,72 h成簇生長;免疫細胞化學法對心肌細胞特異性蛋白α-actin、c-TNT鑒定,其表達結(jié)果呈陽性,即胞漿中有棕黃色顆粒出現(xiàn),且純度達到92%;TGF-β1(20 ng/mL,48 h)作用心肌細胞后

6、,OD490值降低(P<0.01),而LDH外漏量升高(P<0.05);各阻斷劑組處理之后MTT法測得的OD490值升高(P<0.05或者P<0.01),LDH外漏量降低(P<0.05或者P<0.01),且 TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1 I+P38 I、TGF-β1+P38 I組之間,TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1I+JNK I、TGF-β1+JNK I組之間,TGF-β1+TG

7、F-β1 I、TGF-β1+TGF-β1I+ERK I、TGF-β1+P38 I組之間OD490值與乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)外漏量進行比較,均未見顯著性差異;Giemsa染色法證實TGF-β1可誘導心肌細胞產(chǎn)生損傷,而各阻斷劑組可以降低TGF-β1誘導的心肌細胞損傷;Western blot實驗結(jié)果證實,TGF-β1可使心肌細胞p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達上調(diào)(P<0.01),

8、而各阻斷劑組抑制p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白的表達(P<0.01),且TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1 I+P38 I、TGF-β1+P38 I組之間,TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1I+JNK I、TGF-β1+JNK I組之間,TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1 I+ERK I、TGF-β1+P38 I組之間比較,差異不具有統(tǒng)計學意義;而各個

9、組總蛋白的表達均無差異。
  結(jié)論:TGF-β1誘導心肌細胞損傷,其作用機制與 p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達上調(diào)有關(guān),并且MAPK是TGF-β1的下游信號。
  第二部分 OMT調(diào)控MAPK信號保護TGF-β1誘導心肌細胞損傷
  目的:建立TGF-β1誘導新生SD大鼠原代心肌細胞損傷模型,探討OMT對TGF-β1誘導心肌細胞損傷的保護作用及對MAPK家族成員P38、JNK、ERK1/2的影響,闡明

10、OMT對心肌細胞損傷保護作用的機理,為心肌細胞損傷的相關(guān)疾病尋找新的切入點。
  方法:原代心肌細胞培養(yǎng)同第一部分。采用TGF-β1最佳濃度20 ng/ml、作用時間48 h進行模型復(fù)制。實驗共分為6組:Ctrl.,模型組(TGF-β1,20 ng/mL),OMT高劑量組(OMT-H,0.1 mg/mL)、低劑量組(OMT-L,0.05 mg/mL),阿司匹林組(Aspirin,Asp,10-5 mol/L),丹酚酸B組(Salv

11、ianolic acid B,Sal B,50?mol/L)。MTT法檢測細胞的存活率,LDH外漏分析細胞膜損傷程度,Giemsa染色法從形態(tài)學上觀察各組心肌細胞形態(tài)學的變化,Western blot檢測各組p-P38、p-JNK、p-ERK1/2、t-P38、t-JNK及t-ERK1/2蛋白表達水平。
  結(jié)果:通過MTT實驗,LDH試劑盒檢測以及Giemsa染色結(jié)果表明,OMT可有效的減少TGF-β1誘導的心肌細胞損傷。Wes

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