調(diào)控腦卒中后血管新生lncRNAs的發(fā)現(xiàn)及其功能的初步探討.pdf

1、研究背景和目的:
　　缺血性腦卒中是一種嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的腦血管疾病,具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高等特點(diǎn),其治療的關(guān)鍵是及時(shí)、充分恢復(fù)腦缺血區(qū)的血供。臨床觀察發(fā)現(xiàn)腦卒中后可誘發(fā)缺血區(qū)反應(yīng)性血管新生,而且腦組織微血管密度與卒中患者的預(yù)后存有密切關(guān)系。因此,進(jìn)一步闡明腦卒中后血管新生的分子調(diào)控機(jī)制,尋找到有效的分子調(diào)控靶點(diǎn),利用藥物或基因干預(yù)促進(jìn)治療性血管新生有望根本改變目前腦卒中的治療現(xiàn)狀。
　　長鏈非編碼 RN

2、A(long non-coding RNAs)是一類由 RNA聚合酶 II轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的長鏈非編碼 RNA,近年來,研究發(fā)現(xiàn) lncRNAs的表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育特異性,某些 lncRNAs還與參與血管新生過程的多種基因和信號分子關(guān)系密切,但是腦卒中后 lncRNAs的表達(dá)變化如何,lncRNAs是否與其他非編碼 RNAs如 microRNAs等一樣參與腦卒中后的血管新生調(diào)控,目前尚不清楚。本研究通過 Solexa

3、高通量測序檢測大鼠腦缺血后腦組織 lncRNAs的表達(dá)譜變化,生物信息學(xué)分析腦卒中后差異表達(dá)的 lncRNAs,篩選出血管新生相關(guān) lncRNAs,并初步探討腦缺血后血管新生相關(guān) lncRNAs的功能及其可能的調(diào)控機(jī)制。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)篩選腦卒中后血管新生相關(guān) lncRNAs
　　(1)采用zea-longa法建立建立雄性 SD大鼠 MCAO模型,神經(jīng)功能評分、TTC染色及 MRI評估模型。

4、r>　　(2)采用 Solexa基因測序建立腦卒中后缺血腦組織 lncRNAs的表達(dá)譜, real-time PCR隨機(jī)驗(yàn)證 lncRNAs的表達(dá)水平。
　　(3)生物信息學(xué)分析腦卒中后差異表達(dá)的 lncRNAs,篩選血管新生相關(guān)lncRNAs。
　　(4)采用 real-time PCR動態(tài)觀察腦卒中后所篩選出血管新生 lncRNAs MEG3的表達(dá)變化。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)分析所篩選的 lncRNA MEG3對血管新

5、生的調(diào)控功能
　　(1)原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的分離培養(yǎng)與鑒定。
　　(2) HUVEC缺氧模型的建立:采用 real-time PCR檢測 HUVEC缺氧24h VEGFa的表達(dá)變化評估 HUVEC缺氧模型。
　　(3)缺氧對 MEG3和 VEGFa表達(dá)的影響:將正常培養(yǎng)的 HUVEC置于缺氧與常氧環(huán)境中培養(yǎng)12h、24h和48h,real-time PCR檢測 HUVEC缺氧后各個(gè)時(shí)間點(diǎn) MEG3和

6、 VEGFa的表達(dá)變化。
　　(4)構(gòu)建 pCDH-MEG3質(zhì)粒并包裝 Lentiviral-meg3慢病毒。
　　(5)慢病毒感染過表達(dá) HUVEC的 MEG3,real-time PCR驗(yàn)證 MEG3的上調(diào)水平。
　　(6)MEG3過表達(dá)的 HUVEC血管生成能力的檢測:CCK-8法檢測 MEG3過表達(dá) HUVEC的增殖能力,RTCA檢測 MEG3過表達(dá) HUVEC的遷移能力, matrigel成管實(shí)驗(yàn)檢測 MEG

7、3過表達(dá) HUVEC的成管能力。
　　結(jié)果:
　　1、成功建立 SD大鼠 MCAO模型:MCAO大鼠均出現(xiàn)對側(cè)肢體偏癱、行走時(shí)原地轉(zhuǎn)圈和提尾向?qū)?cè)側(cè)身等神經(jīng)功能缺失表現(xiàn),神經(jīng)功能評分2分;TTC染色可見右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)呈蒼白色而周圍正常腦組織呈現(xiàn)紅色;MRI結(jié)果顯示腦梗死 T1像及 DWI像呈高信號;缺血模型梗死灶一致性較好,可用于后續(xù)基因測序。
　　2、腦卒中后缺血腦組織 lncRNAs的表達(dá)譜發(fā)生顯著改變:腦缺

8、血后 Solexa基因測序共檢測出9287條 lncRNAs,與健側(cè)相比缺血側(cè)上調(diào)2倍以上及下調(diào)0.5倍且 P<0.05的 lncRNAs共448條,其中上調(diào)的 lncRNAs有414條,下調(diào)的lncRNAs34條;real-time PCR隨機(jī)驗(yàn)證 lncR-14、lncR-30、lncR-4、lncR-40、lncR-64、lncR-65、lncR-76及 lncR-44的表達(dá)分別上調(diào)2.364±1.074倍、3.836±3.754

9、倍、1.643±1.095倍、5.544±4.774倍、2.504±1.749倍、2.206±1.416倍、1.572±1.095倍、2.389±1.305倍(P<0.05),lncR-41的表達(dá)下調(diào)0.5803±0.4459倍(P<0.05),與 Solexa高通量測序的結(jié)果趨勢一致,成功建立了腦缺血 lncRNAs的表達(dá)譜。
　　3、腦缺血后448條差異表達(dá)的 lncRNAs中,生物信息學(xué)篩選出47條與血管新生相關(guān) lncRN

10、As,其中功能尚未注釋的 lncR41與血管新生相關(guān),生物信息學(xué)分析 lncR41與小鼠 MEG3序列高度同源,提示 lncR41為大鼠 MEG3。
　　4、腦缺血后MEG3的表達(dá)下調(diào):real-time PCR結(jié)果顯示腦缺血24h后MEG3的表達(dá)較健側(cè)下調(diào)0.784±0.124倍(P>0.05),腦缺血48h后 MEG3的表達(dá)較健側(cè)下調(diào)0.502±0.133倍(P<0.05),腦缺血72h后 MEG3的表達(dá)較健側(cè)下調(diào)0.723±

11、0.106倍(P<0.05)。
　　5、缺氧后 MEG3和 VEGFa表達(dá)發(fā)生變化:real-time PCR結(jié)果顯示缺氧后MEG3的表達(dá)呈先下降后上升的動態(tài)變化,即缺氧12h后 MEG3的表達(dá)下調(diào)0.3790±0.0187倍(P<0.05),24h后 MEG3的表達(dá)下調(diào)0.6618±0.0767(P>0.05),48h后 MEG3的表達(dá)上調(diào)3.7559±0.1915倍(P<0.05);缺氧后12h VEGFa的表達(dá)上調(diào)1.749

12、8±0.1916倍(P<0.05),24h后 VEGFa的表達(dá)上調(diào)2.3618±0.2725倍(P<0.05),48h后 VEGFa的表達(dá)上調(diào)2.7400±0.1761倍(P<0.05)。
　　6、成功構(gòu)建出 pCDH-MEG3質(zhì)粒并包裝出 Lentiviral-meg3慢病毒,病毒滴度>6x106/ml。
　　7、慢病毒感染過表達(dá) MEG3抑制 HUVEC的增殖、遷移和成管等血管形成能力,抑制 HUVEC VEGFa和 n