Mfn2通過(guò)調(diào)控TGF-β抑制大鼠腹主動(dòng)脈慢性排斥反應(yīng)及肝纖維化.pdf

1、背景:
　　慢性排斥反應(yīng)屬于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，一般發(fā)生在移植后半年或數(shù)年后，呈進(jìn)行性發(fā)展，其病因及機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，不十分清楚，多由反復(fù)發(fā)作的急性排斥反應(yīng)所造成。慢性排斥反應(yīng)的病理特點(diǎn)為退行性及破壞性改變，表現(xiàn)為血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞、間質(zhì)纖維組織增生及單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。慢性排斥反應(yīng)有一個(gè)共同組織學(xué)表現(xiàn)即移植物動(dòng)脈硬化，移植物動(dòng)脈硬化早期即有明顯的VSMC凋亡，并且VSMC凋亡與血管內(nèi)膜增厚、移植物動(dòng)脈硬化相關(guān)，其特征是泡沫細(xì)胞性閉塞性動(dòng)脈

2、病變，如動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、內(nèi)膜的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及間質(zhì)纖維化。Mfn2基因，又稱為增殖抑制基因(HSG)，它的表達(dá)產(chǎn)物抑制VSMC增殖的同時(shí)能誘導(dǎo)VSMC從處于增殖狀態(tài)的去分化型向分化型轉(zhuǎn)化，即HSG/Mfn2參與VSMC再分化過(guò)程。并且高表達(dá)的HSG/Mfn2基因能促進(jìn)大鼠的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的凋亡。但Mfn2在移植慢性排斥反應(yīng)中的功能及變化尚未有相關(guān)報(bào)道。
　　肝纖維化是指由于細(xì)胞外基質(zhì)的形成和降解的平衡失調(diào)導(dǎo)致肝內(nèi)

3、纖維組織的積累，是許多纖維組織包圍的再生結(jié)節(jié)引起的肝臟結(jié)構(gòu)的廣泛破壞。肝纖維化是肝臟纖維結(jié)締組織的過(guò)度沉積，是纖維增生和纖維分解不平衡的結(jié)果。Mfn2作為一種新型的增殖抑制因子，已有研究表明其能抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，減少血管內(nèi)膜彈性纖維組織的增多。同時(shí)，也已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道在糖尿病腎病模型中，Mfn2高表達(dá)可以抑制腎間質(zhì)纖維化，降低膠原4的表達(dá)。但是Mfn2對(duì)肝臟纖維化的影響尚未有相關(guān)報(bào)道。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究

4、Mfn2對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈移植慢性排斥反應(yīng)的影響以及在肝纖維化過(guò)程中的變化，探索Mfn2在纖維化過(guò)程中所起的作用以及可能的作用機(jī)制，為肝硬化的治療和移植術(shù)后降低慢性排斥反應(yīng)提供一定幫助。
　　方法:
　　1.構(gòu)建Mfn2-GFP慢病毒，并轉(zhuǎn)染供體Lewis大鼠移植段腹主動(dòng)脈。
　　2.將轉(zhuǎn)染Mfn2-GFP的供體Lewis大鼠移植段腹主動(dòng)脈移植到受體Bn大鼠的相應(yīng)位置腹主動(dòng)脈段，并設(shè)立轉(zhuǎn)染GFP慢病毒的陰性對(duì)照組。

5、　　3.分別于30天、60天、90天取下移植段血管，用HE染色法和masson染色法觀察血管內(nèi)膜增厚程度。并采用免疫組化測(cè)定Mfn2和慢性排斥反應(yīng)相關(guān)因子TGF-β1、TGF-βR2的關(guān)系。
　　4.門(mén)靜脈注射Mfn2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠肝臟，并通過(guò)CC14構(gòu)建大鼠肝硬化模型。
　　5.8周后取肝臟行HE和masson染色觀察肝臟形態(tài)，并利用western、免疫組化等技術(shù)檢測(cè)其中Mfn2與纖維化相關(guān)因子TGF-β1、TGF

6、-βR2、Smad3、Smad4、Smad7、膠原Ⅳ、α-SMA的表達(dá)量關(guān)系。
　　6.用Mfn2慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞，利用western檢測(cè)其中Mfn2與纖維化相關(guān)因子TGFβ1、TGFβR2、Smad3、Smad4、Smad7、膠原Ⅳ的相互關(guān)系。
　　7.CCK8、細(xì)胞凋亡、遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)Mfn2的肝星狀細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)masson染色和imagepro-plus6.0軟件測(cè)量

7、移植段大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度，結(jié)果提示，移植后60天和90天，轉(zhuǎn)染Mfn2-GFP的腹主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度明顯小于轉(zhuǎn)染GFP的腹主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度(p＜0.001)。
　　2.免疫組化結(jié)果證實(shí)移植后60天和90天，轉(zhuǎn)染Mfn2-GFP的腹主動(dòng)脈內(nèi)膜的TGF-β1、TGF-β R2的表達(dá)量要低于轉(zhuǎn)染GFP的腹主動(dòng)脈內(nèi)膜(p＜0.01)。
　　3.Masson染色結(jié)果提示:行cc14造肝硬化模型時(shí)，2周即可出現(xiàn)明顯脂肪空泡，但肝臟結(jié)構(gòu)尚正常

8、;4周時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)小葉內(nèi)變性、融合壞死，纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂;6周出現(xiàn)較大范圍的橋接壞死，累及多個(gè)小葉，小葉結(jié)構(gòu)失常，纖維間隔小于0.1mm，但纖維結(jié)節(jié)直徑大于2mm;8周出現(xiàn)較大范圍的橋接壞死，累及多個(gè)小葉，小葉結(jié)構(gòu)失常，纖維間隔小于0.1mm，但纖維結(jié)節(jié)直徑小于1mm。同時(shí)masson染色提示，門(mén)靜脈注射Mfn2-GFP慢病毒的大鼠肝臟行cc14造模8周后，纖維化程度與6周肝硬化模型無(wú)明顯差別(P＞0.05)，低于8周肝硬化模型(P

9、＜0.05)。
　　4.WB和免疫組化結(jié)果提示，肝硬化組Mfn2表達(dá)量小于對(duì)照陰性組和轉(zhuǎn)染Mfn2病毒組(p＜0.05)，同時(shí)TGF-β1、TGF-βR2、Smad3、Smad4和膠原4表達(dá)量大于后兩者(p＜0.05)，提示Mfn2有抑制肝纖維化作用，且有可能是通過(guò)參與TGFβ-Smad通路降低肝纖維化。
　　結(jié)論:
　　1.轉(zhuǎn)染Mfn2的移植段腹主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度明顯小于轉(zhuǎn)染GFP組，同時(shí)免疫組化提示前者TGFβ1和TG