缺血后處理對冷保存大鼠心臟的作用研究.pdf

1、研究背景與目的：供心再灌注損傷的減輕與避免是心臟移植成功的重要條件.若能有效改善供心的功能,這無疑對救治需心臟移植的終末期心臟病患者具有極為重要的意義. 20世紀(jì)80年代中期,Murry等人首次提出心肌在經(jīng)受多次短暫缺血再灌注后能在隨后的長時(shí)間缺血中延遲并減輕心肌損傷,即缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IP)的心肌保護(hù)作用.然而缺血預(yù)處理須在心肌缺血前進(jìn)行施與,對于心臟移植而言,這成為缺血預(yù)處理應(yīng)用

2、于臨床的最大障礙. 2003年Zhao等人首次提出了缺血后處理(ischemic postconditioning)的概念,在缺血期后的再灌注早期,進(jìn)行短暫的、間歇性的缺血和再灌注,即缺血后處理,確實(shí)可以產(chǎn)生和缺血預(yù)處理相類似的明顯的對抗心臟缺血,再灌注損傷的保護(hù)作用.與缺血預(yù)處理相比,缺血后處理方式最大的優(yōu)點(diǎn)在于保護(hù)性的多次短暫缺血,再灌注是施加于缺血發(fā)生之后. 線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial A

3、TP-sensitive potassium channel,mitOKATP)是一組將心肌代謝與細(xì)胞膜電活動(dòng)耦聯(lián)的重要通道,近年來,mitoK<,ATP>通道的激活在心肌保護(hù)中的作用越來越引人注目,大量研究顯示mitoK<,ATP>通道開放劑二氮嗪(diazoxide,DE)預(yù)處理可模捌缺血預(yù)處理效應(yīng),縮小心肌梗死面積、減輕再灌注損傷、促進(jìn)再灌后心功能的恢復(fù)、對缺血心肌具有重要的保護(hù)作用;DE的心肌保護(hù)效應(yīng)能被特異性mitoK<,AT

4、P>通道阻斷劑5-羥基葵酸鹽(5-hydroxydecanoate,5-HD)取消.并且有研究表明,直接在心麻痹液中添力130μM的DE,列長時(shí)程冷保存的離體心臟有顯著的心肌保護(hù)作用.基于以上研究背景,我們推測,缺血后處理或在再灌注初始給予DE可能對長時(shí)程冷保存后再灌注的心臟亦有相似的保護(hù)作用. 因此,本研究利用Langendorff恒壓灌注裝置構(gòu)建離體大鼠心臟冷保存/再灌注模型,在再灌注初始即給予缺血后處理或mitOKATP通

5、道開放劑DE(30μM),觀察缺血后處理對不同冷保存時(shí)間(3h和18h)的離體大鼠心臟的影響.重點(diǎn)在于闡明缺血后處理對冷保存心臟的影響,以及與冷保存后/再灌注早期激活mitOK<,ATP>通道的聯(lián)系. 方法： 1.心臟冷保存模型的構(gòu)建離體大鼠心臟于Langendorff恒壓灌注裝置上平衡30min后,經(jīng)主動(dòng)脈根部灌注4℃的Celsior心麻痹液,灌注時(shí)間控制在3min以內(nèi),心臟表面同時(shí)降溫,待心臟停跳后分別置于不同成分的

6、心麻痹液中(4℃)保存,3h或8h后心臟被重新置于Langendorff裝置上再灌注60min.灌注條件同保存前保持一致.通過:MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)觀察心臟血流動(dòng)力學(xué)的改變,包括:左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室發(fā)展壓力(LVDP)、冠脈流量(CF)、心率(HR)、心率與發(fā)展壓的乘積(RPP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dP/dt<,max>)等. 2.冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)的檢測在再灌注5m

7、in、10min、20min收集冠脈流出液,利用紫外分光光度法測定乳酸脫氫酶(L,DH)的含量. 3.心律失常嚴(yán)重程度的評定各組心臟再灌注時(shí),將兩根心電電極分別放置于肺動(dòng)脈圓錐及心尖部引出心電圖(ECG),通過MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)記錄ECG.根據(jù)記錄到的ECG,采用Curtis和Walker(1988)心律失常評分法對心律失常嚴(yán)重程度進(jìn)行定量分析. 4.心肌含水量的檢測再灌注60min后,留取左心室前壁的一塊

8、心肌,用濾紙拭干,稱取濕重后置于80℃烘箱中烘烤48h,稱心肌干重.心肌水含量=(濕重-千重)/濕重x100﹪. 5.心肌細(xì)胞活性的測定用MTT染色,在550nm處測心肌組織formazan的含量. 6.透射電子顯微鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的改變實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,留取左心室壁上的一塊心肌組織,置入2.5﹪的戊二醛溶液中,制備電鏡標(biāo)本,用透射電子顯微鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的改變. 7.SABC免疫組織化學(xué)法檢測心肌細(xì)胞Fas和Fa

9、s配體(FasL)蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),切取左室心尖部全層心肌,10﹪甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片.根據(jù)Fas/FasL免疫組化試劑盒說明書,采用SABC法檢測心肌細(xì)胞上Fas和FasL蛋白表達(dá)情況.在高倍鏡下檢測,每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野,總計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞左右,胞膜及胞質(zhì)呈棕黃色為Fas或FasI.蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞,胞膜及胞質(zhì)透明不著色為蛋白陰性表達(dá)的細(xì)胞,計(jì)算陽性表達(dá)細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比即為Fas或FasL蛋白陽性染

10、色指數(shù). 8.測定線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道開放情況提取心肌細(xì)胞線粒體,給予200 pmol/L CaCl<,2>作用于線粒體,連續(xù)觀察520 nm,處吸光度的變化以反映線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開放情況. 9.實(shí)驗(yàn)分組 第一部分實(shí)驗(yàn)(觀察缺血后處理對3h冷保存大鼠心臟的作用).SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=8): (1)

11、3h對照組:離體心臟平衡后保存于Celsior心麻痹液中3h,再灌注1h.(2)3h缺血后處理組:離體心臟平衡后保存于Celsior 心麻痹液中3h,再灌注1h,并在再灌注即刻給予短暫缺血后處理(再灌注30s+缺血30s,循環(huán)3次). (3)3h缺血后處理+5-HD組:在缺血后處理中,缺血后處理的再灌注30s時(shí)給予100μmol/L的5-HD,其他同第2組. 第二部分實(shí)驗(yàn)(觀察缺血后處理對8h冷保存大鼠心臟的作用及其可能的作用機(jī)

12、制).SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=8):(1)8h對照組:離體心臟平衡后保存于Celsior心麻痹液中8h,再灌注1h.(2)8h二氮嗪組:再灌注即刻給予30μmol/L的DE,灌注3min,其他同第1組. (3)8h二氮嗪+5HD組:再灌注即刻給予30gmol/L的DE和100gmol/L的5-HD,其他同第1組.(4)8h缺血后處理組:在再灌注即刻給予短暫缺血后處理(再灌注30s+缺血30s,循環(huán)3次),其他同第l組. (5)8h缺血

13、后處理+5-HD組:在缺血后處理的再灌注30s給予100μmol/L的5-HD,其他同第4組. 結(jié)果： 一、缺血后處理對3h冷保存心臟的保護(hù)作用 1、心臟冷保存3h后,再灌注早期給予缺血后處理(再灌注30s+缺血30s,循環(huán)3次),可改善再灌注心臟收縮及舒張功能的恢復(fù),冠脈流量的恢復(fù)、降低再灌注10-20min時(shí)心律失常的嚴(yán)重程度等. 2、缺血后處理對冷保存3h心臟的保護(hù)作用可被mitoK<,ATP>通道

14、特異性阻斷劑5-HD所取消. 二、缺血后處理和DE對8h冷保存心臟的保護(hù)作用 1、在再灌注初始即給予缺血后處理或mitoK<,ATP>通道開放劑DE(30μM),均可明顯改善冷保存8h后/再灌注心臟的收縮及舒張功能的恢復(fù),冠脈流量的恢復(fù)、減少心肌酶的漏出及心肌水腫程度,降低再灌注10-20min時(shí)心律失常的嚴(yán)重程度,提高心肌細(xì)胞的活性等. 2、缺血后處理對冷保存8h后/再灌注心臟的保護(hù)作用與DE心臟保護(hù)作用相似,

15、且均可被mitoK<,ATP>通道特異性阻斷劑5-HD所取消. 3、200 μrnol/L的CaCl<,2>作用于對照組(8h冷保存心臟)心肌線粒體,可引起520 nm處線粒體吸光度下降.與對照組相比,在再灌注初始即給予缺血后處理或DE可明顯抑制CaCl<,2>引起的心肌線粒體吸光度下降,提示mPTP的開放減少.而5-HD可取消DE和缺血后處理減輕CaCl<,2>引起的心肌組織線粒體520nm處吸光度下降的作用(P<0.05).

16、 4、冷保存8h后,心肌細(xì)胞Fas和FasL蛋白表達(dá)增加;與對照組相比較,DE組和缺血后處理組明顯降低冷保存8h心肌細(xì)胞的Fas和FasL蛋白陽性染色指數(shù)(P<0.01);而5-HD可取消以上的作用.結(jié)論缺血后處理可明顯減輕長時(shí)間冷保存后供心的再灌注損傷,其心肌保護(hù)作用是通過激活mitoK<,ATP>通道來完成的;冷保存后激活mitoK<,ATP>通道引發(fā)心肌保護(hù)的機(jī)制可能涉及心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定維持、對心肌細(xì)胞促凋亡蛋白的