pEGFP-N1-α-synuclein真核表達(dá)載體的構(gòu)建及貫葉連翹抗抑郁作用機(jī)制研究.pdf

1、目的： 1.構(gòu)建pEGFP-N1-α-synuclein真核表達(dá)載體，觀察α-synuclein蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況及其對(duì)細(xì)胞的影響。 2.抑郁癥是一種常見的神經(jīng)疾患，嚴(yán)重影響人類的生存質(zhì)量。貫葉連翹被認(rèn)為有抗抑郁作用，其主要有效成分為金絲桃素，貫葉金絲桃素等，在國外主要用于治療輕中度抑郁癥。金得康膠囊是以貫葉連翹提取物為原料藥的現(xiàn)代中藥制劑，其抗抑郁的作用機(jī)理尚不完全清楚。本課題通過一系列研究，探討金得康膠囊及其有效

2、成分對(duì)5-HT受體的影響，及其介導(dǎo)信號(hào)通路的改變，揭明金得康膠囊抗抑郁的作用機(jī)理。 方法： 1.pEGFP-N1-α-syn-uclein 載體的構(gòu)建及與帕金森氏病的相關(guān)研究 (1)pEGFP-N1-α-synuclein真核表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)特異引物，PCR 擴(kuò)增α-synuclein cDNA并引入FLAG標(biāo)簽，克隆入 pEGFP-N1 質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測序，鑒定正確后轉(zhuǎn)化Ecoli．DH5α大腸

3、桿菌，大量擴(kuò)增重組質(zhì)粒。試劑盒純化重組質(zhì)粒。用Lipofectamine<'TM> 2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測報(bào)告基因EGFP表達(dá)產(chǎn)物綠色熒光蛋白、Western blot檢測融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。 (2)MPP<'+>對(duì)PD細(xì)胞模型的影響。構(gòu)建了pcDNA3.1/hisC-α-synuclein真核表達(dá)質(zhì)粒，并建立了該質(zhì)粒在SIt-SY5Y穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，作為PD研究的細(xì)胞模型。3-meth

4、y-4-benzyl-1，2,3，6-terathydrogenpgridine(MPTP)在腦內(nèi)代謝為MPP<'+>，產(chǎn)生氧自由基(ROS)，故用 MPP<'+>誘導(dǎo)產(chǎn)生PD模型。我們以該細(xì)胞株為研究對(duì)象，以不同濃度的MPP<'+>分別作用于轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染α-synuclein的SH-SY5Y細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞存活率及倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。 (3)α-synuclein與凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子關(guān)系的研究。用Li

5、pofectamine<'TM> 2000將α-synuclein和/或 JNK3 (PD相關(guān)基因)轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，采用Western blot方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase3、cytochrom C在細(xì)胞內(nèi)的活性。 2.貫葉連翹提取物有效成分抗抑郁作用及其機(jī)制研究 (1)采用放射配體受體結(jié)合法測定金得康膠囊及其有效成分與大鼠腦組織5-HT<,1>受體的結(jié)合。 (2)本課題組已建立了穩(wěn)定表達(dá)5-H

6、T<,1a>受體的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞株，選取該細(xì)胞株，以不同濃度的金得康膠囊與CHO細(xì)胞共同孵育48h、72h、96h后，提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測 5-HT<,1a>受體表達(dá)情況。 (3)選取穩(wěn)定表達(dá)5-HT<,1a>受體的CHO細(xì)胞，接種于35mm激光共聚焦專用培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后，加入熒光染料FLUO-3 AM Ester，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1h。取出培養(yǎng)皿，洗凈熒光染料，將培養(yǎng)皿放置于激光共聚焦顯微

7、鏡載物臺(tái)，在20×物鏡下，選取細(xì)胞活度、形態(tài)及負(fù)載良好的多個(gè)細(xì)胞，啟動(dòng)機(jī)器進(jìn)行熒光掃描，分別加入離子霉素(陽性對(duì)照)、金絲桃素、金得康膠囊，并繪制胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化的曲線。 (4)選取穩(wěn)定表達(dá) 5-HT<,1>受體的CHO細(xì)胞，接種于60mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后，以培養(yǎng)基稀釋金得康膠囊，以不同濃度，不同時(shí)間與CHO細(xì)胞孵育。按照Cyclic AMP EIA試劑盒說明，檢測細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，分析其變化情況。 結(jié)論：

8、 1.pEGFP-N1-α-synuclein載體的構(gòu)建及與帕金森氏病的相關(guān)研究 (1)本研究成功構(gòu)建了人野生型α-synuclein與綠色熒光蛋白基因融合并加入FLAG標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-α-synuclein。 (2)本研究證實(shí)過表達(dá)α-synuclein 可以參與細(xì)胞凋亡的過程，與野生型SH-SY5Y相比，過表達(dá)α-synuclein的細(xì)胞株對(duì)MPP<'+>誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷具有更高的敏感性。

9、 2.貫葉連翹提取物有效成分抗抑郁作用及其機(jī)制研究 (1)構(gòu)建了5-HT<,1a>受體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的細(xì)胞株，為抗抑郁新藥的篩選及其作用機(jī)制的研究提供了重要的細(xì)胞模型。 (2)放射配體受體結(jié)合測定法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，貫葉連翹提取物和金得康膠囊抗抑郁作用的機(jī)制可能是通過與腦內(nèi) 5-HT<,1>受體結(jié)合，激活下游的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生抗抑郁作用。 (3) 有文獻(xiàn)報(bào)道，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，金得康膠囊原料藥貫葉連翹可以上調(diào)大鼠腦

10、組織5-HT<,1a>受體。實(shí)驗(yàn)表明，金得康膠囊可以在細(xì)胞水平上調(diào)5-HT<,1a>受體，提高受體的敏感性，這與體內(nèi)結(jié)果報(bào)道一致，提示金得康膠囊抗抑郁的作用機(jī)理可能是通過上調(diào) 5-HT<,1a>受體表達(dá)，提高受體敏感性，產(chǎn)生抗抑郁作用。 (4)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放依賴于細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子，對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的檢測結(jié)果表明金得康膠囊和金絲桃素可以明顯提高細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，提示金得康膠囊對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放可能起到調(diào)節(jié)作用。 (5