基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷.pdf

1、目的：1.合成嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ζ的基因，并建立其真核表達(dá)載體；2.用嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ζ基因修飾NK-92細(xì)胞；3.建立荷人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB453（erbB2陽(yáng)性）、MDA-MB231（erbB2陰性）裸鼠皮下移植瘤模型；4.通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)erbB21陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷。
　　 方法：1.設(shè)計(jì)嵌合抗原受體的基因序列，

2、由抗erbB2抗體單鏈可變區(qū)（scFv）、c-myc tag、CD8a（ENST00000283635）、CD28（ENST00000374478）及CD3ζ鏈（ENST00000392122）連接而成，化學(xué)合成長(zhǎng)度為50-70bp的單鏈oligo，利用PCR將合成的oligo拼接成完整的序列，將完整的序列經(jīng)HindⅢ和EcoRI酶切后連接至目的載體PCDNA3.1（+）中。2.用Amaxa Nucleofector技術(shù)將嵌合受體ant

3、i-erbB2scFv-CD28-ζ基因轉(zhuǎn)入NK-92細(xì)胞。3.RT-PCR法檢測(cè)抗原受體mRNAg達(dá)；免疫熒光法檢測(cè)抗原受體在NK-92細(xì)胞表面的表達(dá)。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK-92-scFv-erbB2-CD28-ζ和NK-92細(xì)胞表面CD27、CD158d、NKG2D和CD85j的表達(dá)變化。5.用CCK8法檢測(cè)基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。6.體內(nèi)抗瘤試驗(yàn)：第1個(gè)模型，MDA-MB453細(xì)胞或MDA-MB231細(xì)胞

4、接種于BALB/C裸鼠背部皮下，同時(shí)尾靜脈注射NK-92-scFv-erbB2-CD28-ζ細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的NK-92細(xì)胞，比較各組成瘤率。第2個(gè)模型，MDA-MB453細(xì)胞或MDA-MB231細(xì)胞接種于BALB/C裸鼠背部皮下建立裸鼠皮下移植瘤模型。荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，于第1、8天經(jīng)尾靜脈注射NK-92-scFv-erbB2-CD28-ζ細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的NK-92細(xì)胞。第2、9天分別取小鼠靜脈血用ELISA方法檢測(cè)其中γ-干擾素（IFN

5、-γ）水平。7.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死后取出皮下移植瘤包塊和肺臟，福爾馬林固定，石蠟包埋，切片常規(guī)H&E染色，免疫組化檢測(cè)CD3、NKG2D、CD56、CD16的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.成功合成嵌合抗原受體基因并構(gòu)建其真核表達(dá)載體PCDNA3.1（+）-anti-erbB2 scFv-CD28-ζ。2.RT-PCR結(jié)果證實(shí)了anti-erbB2scFv-CD28-ζmRNA在NK-92細(xì)胞中的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示NK-92細(xì)胞表面嵌

6、合抗原受體anti-erbB2 scFv-CD28-ζ的表達(dá)率為18.89％。3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示兩種NK-92細(xì)胞表面CD27、NKG2D、CD158d、CD85j的表達(dá)沒(méi)有差異。4.anti-erbB2-NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性的MDA-MB453細(xì)胞的殺傷率較親本NK-92細(xì)胞至少提高了3倍，這種殺傷作用的增強(qiáng)是抗原特異性的，因?yàn)閮煞NNK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陰性的MBA-MD231細(xì)胞的殺傷效應(yīng)沒(méi)有顯著差異。我們還證實(shí)A

7、nti-erbB2-NK-92和親本NK-92細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞敏感的K562細(xì)胞的殺傷率同樣很高，說(shuō)明嵌合受體的表達(dá)對(duì)NK-92細(xì)胞的固有細(xì)胞毒活性沒(méi)有影響。5.在體內(nèi)抗瘤第1種模型里，接種MDA-MB453細(xì)胞的裸鼠注射基因修飾的NK-92細(xì)胞后成瘤率（第10天）較注射親本NK-92細(xì)胞低，但接種MDA-MB231細(xì)胞的裸鼠注射這兩種NK-92細(xì)胞的成瘤率沒(méi)有明顯差異。在第2種模型里，接受anti-erbB2基因修飾NK-92細(xì)胞治療的

8、荷MDA-MB453腫瘤小鼠的血清IFN-γ水平高于接受親本NK-92細(xì)胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠。而且，與接受親本NK-92細(xì)胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠相比，接受anti-erbB2基因修飾NK-92細(xì)胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠的腫瘤體積明顯縮小、生存期明顯延長(zhǎng)、肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率低、腫瘤組織中有較多淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)，經(jīng)免疫組化證實(shí)是NK-92細(xì)胞。
　　 結(jié)論：1.成功合成嵌合受體anti-erbB2

9、scFv-CD28-ζ基因并構(gòu)建其真核表達(dá)載體；2.通過(guò)Amaxa Nucleofector技術(shù)實(shí)現(xiàn)嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ζ在NK-92細(xì)胞的高表達(dá)；3.嵌合受體anti.erbB2 scFv.CD28-ζ在NK-92細(xì)胞的表達(dá)不影響NK-92細(xì)胞的表型特征和固有抗瘤活性；4.在體外，基因修飾的NK-92細(xì)胞對(duì)erbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞有特異性殺傷；5.在體內(nèi)，基因修飾的NK-92細(xì)胞可以特異性抑制erbB2陽(yáng)