FE-S域敲除的ABCE1基因過表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株的建立及鑒定.pdf

1、目的:
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率和死亡率已躍居各類惡性腫瘤的首位。全世界范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率與死亡率都呈上升趨勢。目前肺癌的治療以手術(shù)為主，放化療結(jié)合，輔助以生物治療、中醫(yī)治療等多學(xué)科的綜合治療。
　　ABCE1作為RNase L的抑制因子被發(fā)現(xiàn)，編碼蛋白HP68又作為HIV-1病毒殼裝備的必要宿主因子而出現(xiàn)。ABCE1蛋白在2-5A/RNase L通路上，對細(xì)胞抗病毒、細(xì)胞增殖、抗凋亡，進(jìn)一步參與某些腫

2、瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移發(fā)揮著特定的作用。ABCE1對于真核生物蛋白翻譯的起始、延長和終止，以及核糖體的回收充當(dāng)著暫新的角色。
　　ABCE1含有一個(gè)由8個(gè)半胱氨酸殘基組成的N端Fe-S域。N端Fe-S域的半胱氨酸殘基通過與Fe離子形成兩個(gè)反磁性Fe-S(4Fe-4S)域而發(fā)揮作用。最新研究表明，8個(gè)半胱氨酸殘基中，7個(gè)半胱氨酸殘基對Fe-S域的功能是必不可少的，其變異將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Fe-S域是體內(nèi)多種酶發(fā)揮功能必不可少的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，

3、除了作為電子轉(zhuǎn)運(yùn)體外，還是鐵離子的感受器，在蛋白自身穩(wěn)定性調(diào)節(jié)和蛋白與核酸的結(jié)合及修飾過程起重要作用線粒體是Fe-S域合成的中心區(qū)域，F(xiàn)e-S域在線粒體合成后轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿，然后再組裝入蛋白。Fe-S域在核糖體在終止密碼子的識別過程中發(fā)揮不可或缺的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步研究Fe-S域結(jié)構(gòu)對ABCE1的作用，使用被敲掉Fe-S域的ABCE1基因轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，建立表達(dá)為殘缺Fe-S域的ABCE1蛋白的細(xì)胞株，并予以鑒定。
　　方

4、法:
　　1、使用Western blot檢測多種肺癌相關(guān)細(xì)胞系的ABCE1在蛋白水平的表達(dá)，并選取兩種表達(dá)有差異的細(xì)胞株作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　2、構(gòu)建Fe-S域缺失的pEGFP-C1-ABCE1質(zhì)粒，并擴(kuò)增、提取和鑒定。
　　3、Lipofectamin LTX and PLUS介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
　　4、RT-PCR檢測ABCE1在RNA水平的表達(dá)。
　　5、Western blot檢測ABCE1在蛋白水

5、平的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、同屬肺腺癌的LTEP-a-2、A549細(xì)胞株的ABCE1表達(dá)差異明顯，選為轉(zhuǎn)染株，可以排除轉(zhuǎn)染因細(xì)胞自身表達(dá)造成的差異。
　　2、質(zhì)粒構(gòu)建成功后擴(kuò)增、提取和鑒定，結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。
　　3、細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，在48h后熒光顯微鏡可見藍(lán)色熒光。
　　4、在mRNA和蛋白水平上，F(xiàn)e-S域缺失的實(shí)驗(yàn)組與過表達(dá)質(zhì)粒全長對照組的表達(dá)無差異，與空載質(zhì)粒陰性對照組和未轉(zhuǎn)染空白對照組表達(dá)

6、有明顯差異。
　　討論:
　　1、Fe-S域缺失的實(shí)驗(yàn)組ABCE1表達(dá)與過表達(dá)質(zhì)粒全長對照組無差異，為解釋進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞功能方面的差異提供了可能:可認(rèn)為是Fe-S域缺失造成的結(jié)果，從而說明Fe-S域的在腫瘤中可能起到的功能。
　　2、最初想通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Fe-S域敲除的ABCE1蛋白的肺癌細(xì)胞株，并利用G418進(jìn)行細(xì)胞篩選，但實(shí)驗(yàn)2周發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)染pEGFP-C1組出現(xiàn)表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性克隆，而其他組則無