聯(lián)合阻斷CD28和ICOS抑制兔高危角膜移植排斥反應的實驗研究.pdf

1、角膜移植失敗最主要原因是術后免疫排斥反應，高危角膜移植術后免疫排斥反應發(fā)生率高達60％。移植免疫學最新進展表明，在移植物排斥的反應、發(fā)展過程中，T細胞的活化是一個非常復雜的過程，共刺激信號途徑是多樣化的，單純阻斷其中一個通路雖然能夠在一定程度上抑制急性排斥反應的發(fā)生，延長移植物存活時間，但不足以誘導穩(wěn)定、持久的免疫耐受。本實驗擬在兔高危角膜移植模型基礎上，通過聯(lián)合阻斷CD28和ICOS，探討角膜移植中急性排斥反應的機制，以及CTLA～4

2、Ig及：ICOSmAb對角膜移植排斥反應的影響，減少或防止排斥反應發(fā)生，提高移植物存活率。 材料與方法： 一、實驗動物： 新西蘭大白兔，體重1.5-2.0kg，年齡8-12周齡，雌雄不限，購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心。 兔高危角膜移植受體模型的建立：肌肉注射氯胺酮(50mg/kg體重)和氯丙嗪(10mg/kg體重)，聯(lián)合0.4％鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，選擇兔右眼用0/5絲線在偏中央角膜基質間斷縫合3針

3、，平均分布于角膜，針距5mm，深度達2/3角膜基質層。選擇3個以上象限角膜有新生血管的兔右眼用于實驗，當2周后新生血管距角膜中央7mm以內時拆除縫線，并于2-4d后進行穿透性角膜移植術。 穿透性角膜移植術(Penetrating keratoplasty，PKP)方法：穿透性角膜移植在角膜縫線拆除2-4d進行，同樣，氯胺酮(50mg/kg)和氯丙嗪(10mg/kg)混合肌肉注射全身麻醉，角膜新生血管化兔作為受體，取健康新西蘭白兔

4、作為供體。 植片與植床直徑分別為7.5mm和7.0mm，10-0尼龍線間斷縫合12針至水密狀態(tài)，平衡鹽溶液形成前房。術后結膜下注射0.2ml妥布霉素(4mg/ml)，抗生素眼膏涂眼。術后每天滴0.3％氧氟沙星眼液1次/d，持續(xù)1周。 二、實驗一： 選擇大于3個象限，新生血管長入距角膜中央7mm內的20只白兔作為高危即新生血管化模型實驗組；20只健康白兔作為非新生血管化模型實驗組；另健康20只白兔雙眼作為供體。分別

5、將新生血管模型組及非新生血管模型組隨機分成空白對照組：(植片浸在空白保存液中)(4℃孵育18h)，實驗組：植片浸在含有CTLA-4Ig(10ug/ml)保存液中(4℃孵育18h)。穿透性角膜移植術后裂隙燈顯微鏡觀察并記錄角膜植片情況。術后4周或排斥反應發(fā)生時各組4-5只兔的1/2角膜植片分別進行組織病理學和細胞因子原位雜交檢測，檢測腫瘤壞死因子(TNF)在角膜植片中的表達；比較新生血管化與非新生血管化組移植物存活時間。 三、實驗

6、二： 根據(jù)是否給予ICOSmAb以及應用量的多少，隨機分成5組，每組10只。空白對照組(空白保存液)、實驗組：A組(1ug/mlICOSmAb)，B組(10ug/mlICOSmAb)C組(25ug/mlICOSmAb)，D組(250ug/mlICOSmAb)。穿透性角膜移植術后裂隙燈顯微鏡觀察并記錄角膜植片情況。術后4周或排斥反應發(fā)生時抽取靜脈血0.2ml，肝素抗凝，作T淋巴細胞增殖實驗，檢測血液中T淋巴細胞增值能力；術后4周或

7、排斥反應發(fā)生時各組的1/2角膜植片進行組織病理學檢查(HE染色)；術后4周或排斥反應發(fā)生時抽取房水100ul應用RT-PCR檢測白細胞介素2受體(IL-2R)、IL-10的表達；術后4周或排斥反應發(fā)生時余1/2角膜植片應用流式細胞儀檢測T淋巴細胞的表達情況。 四、實驗三： 隨機將新生血管化角膜模型實驗動物分成4組，每組10只。聯(lián)合阻斷組：植片為浸入含有CTLA-4Ig(10ug/ml)和ICOSmAb(10ug/ml)的

8、保存液中。ICOSmAb組：植片為浸入含有ICOSmAb(10ug/ml)的保存液中。CTLA-4組：植片為浸入含有CTLA-4Ig(10ug/ml)的保存液中。對照組：單純行角膜移植，空白保存液。穿透性角膜移植術后裂隙燈顯微鏡觀察并記錄角膜植片情況。術后4周或排斥反應發(fā)生時抽取靜脈血0.2ml，肝素抗凝，作淋巴細胞增殖實驗，檢測血液中T淋巴細胞增值能力；術后6周或排斥反應發(fā)生時各組的1/2角膜植片分別進行組織病理學和細胞因子原位雜交檢

9、測，檢測腫瘤壞死因子(TNF)在角膜植片中的表達：比較各組移植物存活時間。所用數(shù)據(jù)以x±s表示，采取方差分析q檢驗(newman-keuls)。P<0.05為有統(tǒng)計學意義，所有數(shù)據(jù)均由spss11.5軟件處理。 結果： 一、實驗一： (1)在65只新西蘭白兔(65只眼)中僅25只進行角膜新生血管化模型制作，20只兔成功誘導角膜新生血管化并作為受體進行PKP術；另5只兔因發(fā)生感染或未達到模型要求而被淘汰。(2)在非

10、新生血管化角膜移植組：對照組和實驗各組的植片排斥時間或平均植片存活時間上無統(tǒng)計學意義。超過半數(shù)植片(16/30，53％)存活時間超過100天。在新生血管化角膜移植組：實驗組孵育于CTLA-4Ig10ug/ml的植片有較長的生存時間。(3)新生血管化角膜移植組之組織病理學HE染色檢查：移植術后4周或排斥反應發(fā)生時對照組角膜植片水腫，可見新生血管長入，角膜基質中有大量的炎性細胞浸潤，以單核和淋巴細胞為主，實驗組未見明顯的炎性細胞浸潤。(4)

11、原位雜交檢測：移植術后4周或排斥反應發(fā)生時，對照組角膜植片上皮下基質層浸潤細胞有明顯的TNFmRNA的表達，CTLA-4Ig 10ug/ml實驗組未見TNFmRNA表達。 二、實驗二： (1)在78只新西蘭白兔(78只眼)中僅53只進行角膜新生血管化模型制作，50只兔成功誘導角膜新生血管化并作為受體進行PKP術；另3只兔因發(fā)生感染或未達到模型要求而被淘汰。(2)實驗組孵育于ICOSmAb 1ug/ml及ICOSmAb 1

12、0ug/ml的植片有較長的生存時間，植片平均存活時間69±34d，75±31d．實驗A、B組和后兩組比較，移植物存活時間有顯著性差異；而實驗A組和B組比較，移植物存活時間無顯著性差異：而實驗A、B組和對照組比較，移植物存活時間有顯著性差異。(3)組織病理學HE染色檢查：移植術后4周或排斥反應發(fā)生時，對照組及ICOSmAb 250ug/ml實驗組角膜植片水腫，可見新生血管長入，角膜基質中有大量的炎性細胞浸潤，以單核和淋巴細胞為主，ICOS

13、mAb 25ug/ml實驗組可見少量炎性細胞浸潤，而其余實驗組未見明顯的炎性細胞浸潤。(4)移植術后4周或排斥反應發(fā)生時對照組及ICOSmAb 250ug/ml實驗組前房水中可以檢測到IL-2R及IL-10的表達，ICOSmAb 10ug/ml實驗組未檢測到IL-2R及IL-10。(5)移植術后4周或排斥反應發(fā)生時，實驗各組與對照組比較，血液中T淋巴細胞增殖能力無明顯差別。（6)移植術后4周或排斥反應發(fā)生時，對照組與ICOSmAb 25

14、0ug/ml實驗組CD4<'+>和CD8<'+>T淋巴細胞表達均明顯上調。ICOSmAb 25ug/ml實驗組有一定程度的下調，與對照組比較有顯著性差異。CD8<'+>T淋巴細胞表面ICOS表達的平均熒光陽性百分率結果顯示：對照組和ICOSmAb 250ug/ml實驗組之間比較，無顯著性差異，而與其它三組比較，有顯著性差異。未處理組、ICOSmAb 1ug/ml或ICOSmAb 10ug/ml實驗組三組間比較，無顯著性差異。說明ICOS

15、在對照組和ICOSmAb 250ug/ml實驗組表達上調，而在ICOSmAb 1ug/ml或ICOSmAb 10ug/ml實驗組表達上調不明顯，而且與CD4<'+>T淋巴細胞比較，ICOS在CD8<'+>T淋巴細胞表面表達上調的程度并不明顯。 三、實驗三： (1)在65只新西蘭白兔(65，只眼)中僅45只進行角膜新生血管化模型制作，40只兔成功誘導角膜新生血管化并作為受體進行PKP術；另5只兔因發(fā)生感染或未達到模型要求而

16、被淘汰。(2)聯(lián)合阻斷實驗A組孵育于CTLA-4Ig 10ug/ml和ICOSmAb 10ug/ml的植片有較長的生存時間109.33±16.38d，與其他組相比較有統(tǒng)計學意義，而ICOSmAb組與CTLA4-Ig組植片存活時間無顯著性差異。(3)組織病理學HE染色檢查：移植術后6周或排斥反應發(fā)生時，對照組角膜植片水腫，可見新生血管長入，角膜基質中有大量炎性細胞浸潤，以單核和淋巴細胞為主，實驗B、C組實驗組可見少量炎性細胞浸潤，實驗A組

17、未見明顯的炎性細胞浸潤。(4)原位雜交檢測：移植術后6周或排斥反應發(fā)生時，對照組角膜植片上皮下基質層浸潤細胞有明顯的TNFmRNA的表達，實驗B、C組有少許TNFmRNA的表達，實驗A組未見TNFmRNA表達。(5)實驗組與對照組血液中T淋巴細胞增值能力無差別，無明顯統(tǒng)計學意義。 結論： 1．阻斷B7/CD28共刺激信號途徑可以減少或延緩兔高危角膜移植免疫排斥反應，誘導角膜移植免疫耐受。 2．阻斷B7/CD28共