Kringle 5 mut1滴眼液抑制大鼠角膜移植排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、角膜移植是眾多器官和組織移植中成功率最高的，然而移植后的免疫排斥反應(yīng)是角膜移植術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致角膜移植術(shù)失敗的主要原因。其臨床表現(xiàn)多樣，主要有上皮排斥線、上皮水腫粗糙、Bowman層下白色沉積物、植片基質(zhì)層水腫浸潤(rùn)、房水閃輝、角膜后塵狀沉著物、內(nèi)皮排斥線等等。角膜移植的成功率與角膜的血管化、植片大小、眼前段炎癥、眼前段手術(shù)、HLA組織配型等等有關(guān)，例如無血管的角膜，排斥反應(yīng)的發(fā)生率約為9％～12％，但在高度血管化的角膜，發(fā)生

2、率高達(dá)70％以上。 最近，隨著對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)研究的日漸深入，新的藥物及治療方法不斷涌現(xiàn)。除了經(jīng)典的皮質(zhì)類固醇外，新近在臨床上應(yīng)用的藥物還有環(huán)孢霉素A(CsA)及FK506，CsA能選擇性抑制輔助性T細(xì)胞(Th)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，而促進(jìn)抑制性T細(xì)胞(Ts)，但其分子量大，且為疏水性，眼內(nèi)通透性差，影響CsA局部用藥的療效。FK506的作用強(qiáng)度約是CsA的10～100倍，且細(xì)胞毒性小，但由于其價(jià)格昂貴，使其在臨床上的長(zhǎng)

3、期應(yīng)用難以普及。除此之外還有雷帕霉素、FTY720、抗干擾素、抗CD4+/CD8+細(xì)胞單克隆抗體、IL-1受體拮抗劑、TGF—β和IL—2毒素等藥物均可降低角膜移植術(shù)后的免疫應(yīng)答水平，延緩或阻止發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，增加植片的透明度和存活時(shí)間。 纖溶酶原Kringle5是纖溶酶原中與血管抑素相連的一個(gè)聯(lián)環(huán)結(jié)構(gòu)域，由80個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為16KD，它能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，并能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯，具有很強(qiáng)的抑制

4、血管生成活性，已有研究表明Kringle5能有效抑制角膜堿燒傷后新生血管的形成和低氧環(huán)境下視網(wǎng)膜新生血管的形成，并對(duì)某些實(shí)體型腫瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。但有研究發(fā)現(xiàn)Kringle結(jié)構(gòu)阻礙了K5中某些功能性基團(tuán)與內(nèi)皮細(xì)胞的有效作用，用還原劑和烷化劑打斷K5中二硫鍵，可以減輕這種掩蓋效應(yīng)，充分暴露有效基團(tuán)。有研究表明這種經(jīng)過構(gòu)建的纖溶酶原Kringle5突變體(mutant1)具有更強(qiáng)的抑制新生血管的作用。 本研究擬通過制備大鼠角膜移

5、植模型，并將Kringle5 mut1滴眼液應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性角膜移植術(shù)后，觀察其抑制免疫排斥反應(yīng)的療效，并探討其機(jī)制，從而為其臨床推廣使用提供理論依據(jù)。 第一部分動(dòng)物模型的制備及Kringle5 mut1滴眼液的療效觀察 目的：制備大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)動(dòng)物模型，觀察Kringle5 mut1滴眼液治療角膜移植免疫排斥反應(yīng)效果，并探討其最佳治療濃度。 方法：以F344大鼠為供體，Lewis大鼠為受體建立角膜移植排斥

6、反應(yīng)模型，采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)方案將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組，A組為F344鼠自體原位角膜移植，B、C、D、E組為F344-Lewis鼠之間進(jìn)行同種異體角膜移植。術(shù)后即一日四次點(diǎn)眼藥水，A組和B組滴載體溶液，C組和D組給予的Kringle5 mut1滴眼液濃度分別為5mg/L和10mg/L，E組給予0.1％地塞米松滴眼液，共14天。根據(jù)Holland排斥反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，判斷術(shù)后植片排斥情況。比較各組角膜植片的平均存活時(shí)間，并觀察角膜新生血管生長(zhǎng)情

7、況，計(jì)算其面積。術(shù)后14天，對(duì)各組角膜植片做組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果：C、D組發(fā)生排斥反應(yīng)的時(shí)間較B組明顯延遲，B組植片平均存活時(shí)間(MST)為(9.3±2.1)d，C、D組MST分別為(21.1±7.3)d和(23.5±10.8)d，它們分別與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。E組植片存活情況較C、D組好，但組間比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后A、B、C、D、E組角膜新生血管開始出現(xiàn)的時(shí)間分別為(3.1±

8、0.8)d、(2.6±0.5)d、(6.4±0.5)d、(7.8±0.7)d、(5.3±1)d，其中C、D、E組較A、B組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，C、D及E組兩兩組間比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，D組出現(xiàn)NV最晚。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)C及D組角膜新生血管的生長(zhǎng)面積明顯較B組少(P<0.05)，并且與E組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。角膜植片病理學(xué)檢查，B組可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及角膜新生血管形成，而C組機(jī)D組植片炎癥發(fā)應(yīng)較輕，基本

9、無新生血管形成。 結(jié)論：兩種濃度Kringle5 mut1滴眼液都能夠延緩大鼠角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，并能夠抑制術(shù)后新生血管的生成，其中10mg/L濃度組治療效果較佳。 第二部分Kringle5 mut1滴眼液及聯(lián)合地塞米松滴眼液治療角膜移植排斥反應(yīng)的研究 目的：觀察10mg/L濃度的Kringle5 mut1滴眼液及聯(lián)合0.1％地塞米松滴眼液治療角膜移植免疫排斥反應(yīng)效果，并探討其抑制機(jī)制。 方法：以F3

10、44大鼠為供體，Lewis大鼠為受體建立角膜移植排斥反應(yīng)模型，采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)方案將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組(A、B、C、D組)，術(shù)后即一日四次點(diǎn)眼藥水，A組滴載體溶液，B組和C組分別給予10mg/L的Kringle5 mut1滴眼液和0.1％地塞米松滴眼液，D組為10mg/L的Kringle5 mut1滴眼液+0.1％地塞米松滴眼液聯(lián)合用藥組，共滴14天。實(shí)驗(yàn)觀察期間對(duì)各組大鼠角膜植片存活情況、透明性、基質(zhì)水腫情況、新生血管的生長(zhǎng)進(jìn)行比較

11、。并于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(3d、7d、10d、14d)取下角膜，HE染色觀察各組角膜組織病理變化。并運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法和ELISA法檢測(cè)和比較各時(shí)間點(diǎn)各組間腫瘤壞死因子—α(Tumor necrosis factor—α，TNF—α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)水平和部位。 結(jié)果：B、C、D組發(fā)生排斥反應(yīng)的時(shí)間較A組明顯延遲，A組植片平均存活時(shí)間(MST

12、)為(9.3±2.1)d.B、C、D組MST分別為(23.5±10.8)d、(28.2±19.1)d和(39.8±16.5)d，它們分別與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。D組植片存活情況較B、C組好，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后A、B、C、D組角膜新生血管開始出現(xiàn)的時(shí)間分別為(2.6±0.5)d、(7.8±0.7)d、(5.3±1)d和(8.2±1.1)d，其中B、C、D組較A組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，B、D組

13、與C組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。角膜植片病理學(xué)檢查，A組可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及角膜新生血管形成，而B組、D組植片炎癥發(fā)應(yīng)較輕，基本無新生血管形成，其中D組最顯著。免疫組織化學(xué)顯示B、C、D組的TNF—α和VEGF表達(dá)水平較A組低，其中D組最低。ELISA法顯示植片中TNF—α、VEGF的表達(dá)總體上是逐漸降低的。B、C、D組的TNF—α和VEGF含量與A組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，并且C組的VEGF含量與B、D組比較有