脊神經(jīng)后根吻合軸突再生重建感覺傳入通路的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊神經(jīng)根包括前根(ventral root)和后根(dorsal root)，分別屬于運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)纖維，每條脊神經(jīng)(spinal nerve)通過前根和后根與脊髓相連。后根上的脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(dorsal root ganglion,DRG)為假單極神經(jīng)元，其發(fā)出內(nèi)側(cè)的中樞突支(central processes)和外側(cè)的周圍突支(peripheral processes)分別構(gòu)成后根進(jìn)入脊髓或與前根匯合形成脊神經(jīng)分布至外周感受器或效應(yīng)

2、器。后根大部分軸突位于脊髓外，屬于周圍神經(jīng)系統(tǒng)（peripheral nervous system,PNS），表面髓鞘主要由Schwann細(xì)胞構(gòu)成；少部分軸突走行于脊髓內(nèi)，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS），其表面髓鞘由少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞包裹。外周感受器接受機(jī)械性或化學(xué)性刺激，轉(zhuǎn)為神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)經(jīng)外周神經(jīng)進(jìn)入DRG，繼而經(jīng)后根進(jìn)入脊髓，產(chǎn)生感覺或?qū)崿F(xiàn)對(duì)肌肉運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。
　　脊神經(jīng)根纖維膠

3、原含量少、可伸展性低，纖維之間呈平行排列,而外周神經(jīng)纖維呈叢狀排列，可伸展性高。此外，脊神經(jīng)根缺乏神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜結(jié)構(gòu)，僅存在神經(jīng)內(nèi)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的血-神經(jīng)屏障；DRG細(xì)胞周圍毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞為縫隙樣連接，血-神經(jīng)屏障、神經(jīng)束膜細(xì)胞成分的保護(hù)均不完善。DRG存在感覺、運(yùn)動(dòng)相互調(diào)控的物質(zhì)基礎(chǔ)和形態(tài)學(xué)依據(jù)，感覺傳入可以影響肌肉的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和運(yùn)動(dòng)幅度。后根受損除了因相應(yīng)支配區(qū)域感覺興奮傳入通路中斷出現(xiàn)感覺喪失，還由于運(yùn)動(dòng)反射弧的

4、完整性破壞，會(huì)引起肌肉運(yùn)動(dòng)功能失常。
　　隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，交通、建筑等行業(yè)出現(xiàn)的高沖擊能量性事故導(dǎo)致截癱、馬尾神經(jīng)、臂叢神經(jīng)根性撕脫傷等引起的運(yùn)動(dòng)、感覺功能障礙治療和康復(fù)是臨床面臨的巨大難題。肖傳國等最早提出利用大鼠L4－L6前根吻合軸突再生重建“人工體神經(jīng)－內(nèi)臟神經(jīng)反射弧”，侯春林等利用犬L6－S2前根吻合重建脊髓損傷弛緩性膀胱人工反射弧、并予一名患者行T11－S2前根經(jīng)腓腸神經(jīng)移植橋接吻合重建“腹壁反射－脊髓中樞－膀胱

5、”人工反射弧均取得滿意效果。然而，后根損傷再生及感覺功能恢復(fù)目前尚面臨較大困難。
　　哺乳動(dòng)物后根損傷會(huì)引起脊髓后根入口(dorsal root entryzone,DREZ)膠質(zhì)瘢痕增生、產(chǎn)生膠質(zhì)界膜及各種炎性介質(zhì)因子等，導(dǎo)致DRG后根軸突再生無法進(jìn)入脊髓。針對(duì)這一難題，目前國內(nèi)外主要的解決方式包括：應(yīng)用胚胎干細(xì)胞或嗅鞘細(xì)胞等具備潛在分化能力的細(xì)胞移植；各種神經(jīng)營養(yǎng)因子如睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aF

6、GF)等的直接應(yīng)用或修飾表達(dá)該基因的病毒載體聯(lián)合應(yīng)用；外周神經(jīng)如肋間神經(jīng)、腓神經(jīng)等橋接吻合等。然而，以上治療方法并不完全適用于人體。
　　本課題擬探索一種新的后根吻合重建術(shù)式，通過Neuro-DiI及辣根過氧化物酶神經(jīng)示蹤，降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)免疫組化染色及神經(jīng)元存活率檢測，結(jié)合光鏡和透射電鏡等綜合評(píng)價(jià)軸突再生及手術(shù)效果，為后根再生重建感覺傳入通路奠定組織學(xué)基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一、脊神經(jīng)后根部分切斷交叉吻合軸突再生的實(shí)驗(yàn)

7、研究
　　目的：觀察后根部分切斷交叉吻合重建后軸突再生能力。
　　方法：SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組，將右側(cè)L4和L6后根各自等分為2束，隨機(jī)選擇其中一束切斷，實(shí)驗(yàn)組兩遠(yuǎn)斷端行端－端吻合，假手術(shù)組不予吻合；所有動(dòng)物左側(cè)L4和L6后根保持完整作為正常對(duì)照側(cè)。術(shù)后3個(gè)月分別經(jīng)L4和L6脊神經(jīng)節(jié)注射Neuro-DiI進(jìn)行神經(jīng)示蹤，脊髓降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)免疫組化染色觀察后根軸突在脊髓后角分布情況，神經(jīng)纖維銀染計(jì)算單位面

8、積內(nèi)后根軸突數(shù)量。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組可見DiI標(biāo)記神經(jīng)纖維通過吻合口并到達(dá)對(duì)側(cè)脊神經(jīng)節(jié)。右側(cè)L4節(jié)段脊髓后角CGRP陽性軸突終末分布密度在實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照側(cè)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但假手術(shù)組顯著低于實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照側(cè)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組單位面積內(nèi)(mm2)軸突數(shù)量與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與正常對(duì)照側(cè)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：后根部分切斷交叉吻

9、合后軸突能夠再生通過吻合口，吻合口兩側(cè)脊神經(jīng)節(jié)間存在建立互相產(chǎn)生信息傳遞的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)二、脊神經(jīng)后根橫斷吻合修復(fù)方法的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討治療后根損傷修復(fù)的更有效方法，為重建感覺傳入通路奠定組織學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，均將右側(cè)L6后根盡量靠近脊髓端切斷。另外，在A組右側(cè)L4后根于脊神經(jīng)節(jié)前3-5mm處切斷，近斷端與右側(cè)L6后根遠(yuǎn)斷端吻合；B組右側(cè)L4后根于脊神經(jīng)節(jié)后3mm處切斷

10、，近斷端與右側(cè)L6后根遠(yuǎn)斷端吻合；C組手術(shù)操作同B組，但不吻合作為假手術(shù)組。所有動(dòng)物左側(cè)L4和L6后根保持完整作為正常對(duì)照側(cè)。術(shù)后3個(gè)月經(jīng)L6脊神經(jīng)節(jié)注射Neuro-DiI進(jìn)行神經(jīng)示蹤，脊髓CGRP免疫組化染色觀察后根軸突在脊髓后角分布情況，形態(tài)學(xué)及電鏡觀察神經(jīng)纖維數(shù)量及髓鞘厚度，綜合評(píng)價(jià)手術(shù)及軸突再生效果。
　　結(jié)果：A組和B組均可見DiI示蹤軸突再生通過吻合口，神經(jīng)纖維數(shù)量和髓鞘厚度與正常對(duì)照側(cè)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0

11、5)；C組神經(jīng)纖維數(shù)量和髓鞘厚度均低于其它各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組后根軸突再生停止于DREZ，脊髓后角CGRP陽性纖維分布密度低于B組和正常對(duì)照側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組L4脊神經(jīng)節(jié)可見DiI陽性標(biāo)記神經(jīng)元，后根CGRP陽性神經(jīng)纖維通過DREZ進(jìn)入脊髓后角，纖維分布密度與正常對(duì)照側(cè)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：處于脊神經(jīng)節(jié)前的后根損傷修復(fù)，軸突再生無法穿越DREZ區(qū)域，效果欠

12、佳；處于脊神經(jīng)節(jié)后的后根損傷修復(fù)，吻合口軸突再生，后根神經(jīng)纖維與脊髓后角突觸聯(lián)系保持完整，存在感覺信息經(jīng)傳入纖維穿越DREZ至髓內(nèi)第二級(jí)感覺神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)依據(jù)，是一種理想的修復(fù)感覺傳導(dǎo)通路的方式。
　　實(shí)驗(yàn)三、脊神經(jīng)前后根切斷吻合軸突再生后的神經(jīng)纖維追蹤及脊髓前/后角和脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的變化
　　目的：脊神經(jīng)前、后根吻合軸突再生后，進(jìn)一步觀察神經(jīng)傳導(dǎo)通路的建立及脊髓前、后角和脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的變化情況，探討聯(lián)合應(yīng)用前、后根軸突再

13、生重建運(yùn)動(dòng)、感覺傳導(dǎo)的可行性。
　　方法：SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，A組：行右側(cè)L4前根近斷端與右側(cè)L6前根遠(yuǎn)斷端吻合；再分別將右側(cè)L4后根于脊神經(jīng)節(jié)前3-5mm處切斷、右側(cè)L6后根盡量靠近脊髓端切斷，L4后根近斷端與L6后根遠(yuǎn)斷端吻合。B組：行右側(cè)L4前根近斷端與右側(cè)L6前根遠(yuǎn)斷端吻合；再分別將右側(cè)L4后根于脊神經(jīng)節(jié)后3mm處切斷、右側(cè)L6后根盡量靠近脊髓端切斷，L4后根近斷端與L6后根遠(yuǎn)斷端吻合；C組手術(shù)操作同B組，但前

14、、后根均不吻合作為假手術(shù)組。所有動(dòng)物左側(cè)L4和L6前、后根不予處理作為正常對(duì)照側(cè)。術(shù)后3個(gè)月分別經(jīng)坐骨神經(jīng)和L6脊神經(jīng)節(jié)注射辣根過氧化物酶(HRP)神經(jīng)示蹤，尼氏體染色觀察脊髓前、后角和脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元形態(tài)變化。
　　結(jié)果：B組右側(cè)L4脊髓節(jié)段前、后角及L4脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)均發(fā)現(xiàn)HRP標(biāo)記神經(jīng)元，而A組僅右側(cè)L4脊髓節(jié)段前角出現(xiàn)HRP標(biāo)記細(xì)胞，脊髓后角未發(fā)現(xiàn)HRP標(biāo)記細(xì)胞。A、B兩組右側(cè)L4脊髓節(jié)段前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞存活率與正常對(duì)照側(cè)比較

15、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但C組脊髓前角神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組右側(cè)L4脊髓節(jié)段后角神經(jīng)元存活率與正常對(duì)照側(cè)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但A、C兩組后角神經(jīng)元存活率與正常對(duì)照側(cè)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A、B、C三組右側(cè)L6脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活率與正常對(duì)照側(cè)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：前根、脊神經(jīng)節(jié)后的后根吻合重建，脊髓前角、后角神經(jīng)元存活情