漢坦病毒感染THP-1細胞激活炎癥小體通路及其分子機制的初步研究.pdf

1、漢坦病毒(Hantavirus)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、漢坦病毒屬(Hantaviruses),有20多個不同的型別。其中的漢灘病毒(Hantaanvirus,HTNV)、漢城病毒(Seoulvirus,SEOV)、普馬拉病毒(Puumalavirus,PUUV)等主要引起腎綜合征出血熱(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,HFRS),而辛諾柏病毒(SinNombrevirus,SN

2、V)等主要引起漢坦病毒肺綜合征(hantaviruspulmonarysyndrome,HPS)。我國流行的漢坦病毒主要是引起HFRS的HTNV和SEOV,尚未發(fā)現(xiàn)引起HPS的病毒;而且我國是世界上HFRS疫情最嚴重的國家,流行范圍廣,發(fā)病人數(shù)多,病死率較高,是我國危害最嚴重的急性傳染病之一。
　　目前HFRS的發(fā)病機制尚未完全闡明,學(xué)術(shù)界普遍認為除了病毒感染直接損傷外,免疫病理損傷導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增高和血漿滲漏是HFRS的主要

3、病理基礎(chǔ),其中大量炎癥因子的產(chǎn)生是其發(fā)生的主要分子基礎(chǔ)。已有多項研究顯示,HFRS患者外周血中多種細胞因子如VEGF、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-8、IP-10、RANTES等表達水平增多,這些因子與炎癥發(fā)生密切相關(guān)。其中主要由單核/巨噬細胞產(chǎn)生的IL-1β是一種典型的促炎分子,廣泛參與機體的炎癥反應(yīng),并可作為內(nèi)源性熱原質(zhì)引起機體發(fā)熱反應(yīng),近年來受到廣泛關(guān)注。由于HFRS的三大主癥之一就是發(fā)熱,同時多項早期的研究

4、表明,HFRS患者體內(nèi)IL-1β的水平在疾病進程早期即有明顯的升高,因此IL-1β在HFRS疾病進程中可能起到了一定的作用。
　　最新研究表明,炎癥小體通路活化是產(chǎn)生IL-1β等細胞因子的主要機制,而且多種病毒感染可激活炎癥小體通路。因此,本研究旨在明確漢坦病毒感染人外周血單核細胞THP-1后是否可產(chǎn)生IL-1β,并探討IL-1β的產(chǎn)生是否與炎癥小體通路的活化相關(guān)及其具體分子機制,從而為進一步闡明IL-1β在漢坦病毒感染致病中的作

5、用及其機制等提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　【主要實驗方法和研究結(jié)果】
　　1.HTNV可感染THP-1細胞并復(fù)制
　　利用乳鼠腦擴增HTNV76-118株,制備病毒懸液,用微量細胞培養(yǎng)法測定病毒滴度為1.95×106PFU/ml。取MOI=10的HTNV分別感染THP-1、HUVEC和VeroE6細胞,24h后用FITC標記的抗?jié)h坦病毒核衣殼蛋白的mAb進行免疫熒光檢測,結(jié)果顯示:在THP-1、HUVEC、VeroE6細胞

6、的胞漿中均可見特異的綠色熒光顆粒,但是在THP-1細胞中的綠色熒光顆粒較HUVEC、VeroE6細胞中的為少。這提示HTNV可以感染THP-1細胞并增殖,但其復(fù)制水平低于在VeroE6細胞和HUVEC中的復(fù)制水平。
　　2.HTNV感染THP-1細胞后可誘導(dǎo)表達IL-1β
　　用MOI=1、MOI=2和MOI=10的HTNV76-118株分別感染THP-1細胞,同時設(shè)LPS、ATP刺激為陽性對照,滅活病毒為陰性對照組,2h后

7、換液并繼續(xù)培養(yǎng)細胞;24h后收集細胞上清,用ELISA檢測其中的IL-1β。結(jié)果顯示,不同MOI的HTNV均可誘導(dǎo)THP-1細胞產(chǎn)生IL-1β,使用的病毒量越大,細胞分泌IL-1β的水平也越高。為觀察LPS預(yù)刺激是否影響HTNV感染THP-1細胞產(chǎn)生IL-1β的水平,先用0.05mg/ml的LPS對細胞預(yù)刺激2h,并設(shè)無LPS預(yù)刺激組;之后用MOI=0.1、MOI=2的HTNV分別進行感染,2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細胞;24h后收集細胞上清

8、,用ELISA檢測其中的IL-1β。結(jié)果顯示,LPS預(yù)刺激對HTNV感染THP-1細胞生成IL-1β的水平?jīng)]有明顯影響。為觀察病毒感染細胞后不同時間點IL-1β水平的變化,用MOI=1、MOI=10的HTNV感染THP-1細胞,2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細胞,分別在6h、24h和48h收集細胞上清,用ELISA檢測其中的IL-1β。結(jié)果顯示,感染的THP-1細胞生成的IL-1β水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,其中在24h時檢測到的IL-1β水平最

9、高;MOI=10的病毒感染THP-1細胞表達IL-1β的水平升高后下降趨勢比MOI=1時的下降趨勢減緩。以上實驗結(jié)果說明HTNV感染THP-1細胞誘導(dǎo)表達了IL-1β。
　　用1mM的蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理THP-1細胞2h,用MOI=10的HTNV感染細胞,2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細胞;24h后收集細胞上清,用ELISA檢測其中的IL-1β。結(jié)果顯示,MG132處理細胞后,可明顯抑制HTNV感染THP-1生成IL-1β的水平

10、,這提示HTNV感染細胞后IL-1β的產(chǎn)生不是病毒直接作用的結(jié)果,而是通過病毒活化某種分子通路所介導(dǎo)的。
　　3.HTNV感染THP-1細胞激活了炎癥小體通路相關(guān)分子
　　用MOI=10的HTNV76-118株和滅活的該毒株分別感染THP-1細胞,2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細胞;在感染后6h、24h分別收集細胞,并提取細胞RNA后進行反轉(zhuǎn)錄,用qRT-PCR檢測炎癥小體通路中NLRP3、ASC、caspase-1及RIG-I的mR

11、NA水平。結(jié)果顯示,與未感染組相比,HTNV活毒株和滅活毒株感染THP-1細胞中NLRP3、RIG-I分子的mRNA水平?jīng)]有明顯變化,而接頭分子ASC的mRNA則在6h時開始有顯著的升高,caspase-1的mRNA水平在24h時有顯著的升高。用MOI=10的HTNV感染THP-1細胞,同時設(shè)LPS及ATP作為陽性對照處理THP-1細胞,2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細胞;在感染后6h和24h后分別收集細胞和培養(yǎng)上清,用Westernblot檢測

12、pro-caspase-1、pro-IL-1β及caspase-1。結(jié)果顯示,HTNV感染THP-1細胞和LPS+ATP陽性對照組細胞中pro-caspase-1及pro-IL-1β水解單體水平均明顯高于未感染組;HTNV感染THP-1細胞和LPS+ATP陽性對照組細胞上清中的caspase-1水平明顯高于未感染組。
　　4.HTNV感染THP-1細胞激活炎癥小體不依賴于K+外流
　　為檢測K+外流是否作為HTNV感染THP

13、-1細胞激活炎癥小體的潛在機制,我們用3MKCl加入THP-1細胞中作用2h,再用MOI=10的HTNV76-118株感染細胞,2h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)細胞;24h后收集細胞上清,用ELISA檢測其中的IL-1β,結(jié)果顯示,當胞外有或無高濃度的K+存在時,HTNV均可誘導(dǎo)THP-1細胞產(chǎn)生IL-1β,兩者水平相當,表明HTNV刺激炎癥小體通路不依賴K+外流。
　　【結(jié)論】
　　漢坦病毒感染THP-1細胞后可產(chǎn)生IL-1β,炎癥小